Inverses Forschungsmikroskop mit STED-Modul
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Großgeräte-Paketantrags „STED/RESOLFT“ war die technische Prototyp-Entwicklung einer komplementären Superresolution-Imaging-Plattform, welche die Stärken und Schwächen zweier „targeted imaging"-Systeme für möglichst flexible Anwendungen in primären Herzzellen und Geweben erschließt. Wie beantragt wurde ein STED-Prototyp (STimulated Emission Depletion) erworben und in der Pilotprojekt-Kollaboration mit dem Hersteller erweitert. Parallel wurde wie geplant ein modulares RESOLFT-Entwicklersystem (REversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions) angeschafft und in Kollaboration mit dem Hersteller (Biotech-Ausgründung) für Mehrfarben-Anwendungen technisch entwickelt. Die entstandende Nutzer-Plattform bietet einerseits die hohe Auflösung und Bild-Geschwindigkeit von STED, andererseits geringe Phototoxizität durch die sehr niedrige Lichtenergie von RESOLFT, und wie geplant wurden die komplementären Gerätesysteme integriert. Der STED-Prototyp und geplante Applikationen wurde zunächst in Pilotstudien für stabile und effiziente 1-, 2- und 3-Farben STED-Anwendungen für kardiale Zell- und Gewebe-Proben entwickelt. Dies beinhaltete auch eine Geräte-Modifizierung und die Überwindung vieler technischer Probleme in kleinen Schritten, eigene teils Geräte-spezifische oder teils veröffentlichte Applikationsentwicklungen, und die weiterführende konzeptionelle Entwicklung für den Einsatz als Nutzer-Plattform „hochauflösende Mikroskopie“ innerhalb eines neuen Service-Projekts im Rahmen des SFB 1002 „Modulatory Units in Heart Failure“. Das STED-Großgerät wurde für die Erforschung charakteristischer intrazellulärer Membran- und Protein-Strukturen eingesetzt, welche die elektromechanische Kopplung („EC-coupling“) in kleinsten Reaktionsräumen vermitteln (sog. Nanodomänen). In Herzmuskelzellen kommen EC-coupling-Nanodomänen in relativ großer Zahl vor (schätzungsweise 20.000). Andererseits kommt es bei vielen Herzerkrankungen zu pathophysiologisch bedeutsamen EC-coupling-Nanodomänen-Veränderungen, die zellbiologisch unvollständig verstanden sind. Die STED/RESOLFT-Plattform hat entscheidend durch hochauflösende bildgebende Untersuchungen von subzellulären Strukturen zum Beispiel von komplexen Ryanodin-Rezeptor (RyR2)/Ca2+-Freisetzungskanal-Clustern jeweils in atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten zu neuen Einsichten über lokale Struktur-Funktionsbeziehungen und zu neuen EC- coupling-Modellen und Modellierungsansätzen intrazellulärer Calcium-Nanodomänen beigetragen. Zusätzlich konnten erstmals signifikante morphologische Unterschiede des intakten transversal-axialen Tubuli-Membraninvagination-Systems (TATS) zwischen atrialen und ventrikulären Herzmuskelzellen durch STED-Mikroskopie in lebenden Kardiomyozyten identifiziert werden. Parallel wurde der STED-Prototyp für intrazelluläre Struktur-Untersuchungen in interventionellen Mausmodellen mit progredienten Herzerkrankungen eingesetzt. Dabei wurden Krankheitsmodelle über funktionelle Veränderungen von Membran-lokalisierten Signaldomänen durch STED-Kolokalisationsanalysen überprüft. Systematisch wurden verschiedene Membran-Domänen auf ihre räumliche und molekulare Spezialisierung in Bezug auf deren Protein- und Lipid-Zusammensetzung analysiert, zum Beispiel wurden Caveolin-Isoformen, verschiedene Ionenkanäle und Cholesterol-haltige Domänen in lebenden und fixierten Proben quantitativ untersucht. Schließlich wurden in translationalen Projekten immunhistologische Untersuchungen humaner Herz-Biopsien mittels STED-Mikroskopie sowie STED-Markierungsstrategien von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in zellulären Signaldomänen mit neu entwickelten hochaffinen fluoreszenten Liganden etabliert. Der durch das Großgeräte-Pilotprojekt erreichte STED-Prototyp leistet, im Berichtszeitraum aber auch prospektiv gesehen, wie erhofft einen entscheidenen Beitrag für die hochauflösende kardiale Bildgebung und seit 2017 in speziellen Imaging-Räumen des Herzforschungszentrums Göttingen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2014). Super Resolution Modeling of Calcium Release in Heart. Biophys J 107(12): 12
Mark A. Walker, G. S. B. Williams, Tobias Kohl, S.E. Lehnart, M.S. Jafri, J.L. Greenstein, W.J. Lederer, R.L. Winslow
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(2015). On the Adjacency Matrix of RyR2 Cluster Structures. PLoS Comput Biol 11(11): e1004521
Walker, M.A., T. Kohl, S.E. Lehnart, J.L. Greenstein, W.J. Lederer, R.L. Winslow
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(2016). Axial tubule junctions control rapid calcium signaling in atria. J Clin Invest 126(10): 3999-4015
Brandenburg, S., T. Kohl, G. S. Williams, K. Gusev, E. Wagner, E. A. Rog-Zielinska, E. Hebisch, M. Dura, M. Didie, M. Gotthardt, V. O. Nikolaev, G. Hasenfuss, P. Kohl, C. W. Ward, W. J. Lederer and S. E. Lehnart
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(2016). Reduced coumarin dyes with an O-phosphorylated 2,2- Dimethyl-4-(hydroxymethyl)-1,2,3,4-tetrahydroquinoline fragment: synthesis, spectra, and STED microscopy. Chemistry 22(33): 11631-11642
Nizamov S, Sednev MV, Bossi ML, Hebisch E, Frauendorf H, Lehnart SE, Belov VN, Hell SW
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(2017). A protocol for registration and correction of multicolour STED superresolution images. J Microsc 267(2): 160-175
Hebisch, E., E. Wagner, V. Westphal, J. J. Sieber and S. E. Lehnart
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(2017). Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO Journal
Richter, K.N., N.H. Revelo, K.J. Seitz, M.S. Helm, D. Sarkar, R. Saleeb, E. D’Este, J. Eberle, E. Wagner, C. Vogl, D.F. Lazaro, F. Richter, J.C. Vegara, G. Coceano, E. Boyden, R. Duncan, S.W. Hell, M. Lauterbach, S.E. Lehnart, T. Moser, T. Outeiro, P. Rehling, B. Schwappach, I. Testa, B. Zapiec, S.O. Rizzoli
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High-Affinity Functional Fluorescent Ligands for Human β- Adrenoceptors. Scientific Reports 2017 Sep 26;7(1):12319
Mitronova, G.Y., G. Lukinavičius, A.N. Butkevich, T. Kohl, V.N. Belov, S.E. Lehnart and S.W. Hell
