Zöliakiepathogenese: Aufklärung kovalenter Konjugate zwischen Gewebstransglutaminase und Peptiden aus Glutenproteinen verschiedener Getreidearten
Lebensmittelchemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Präparationsarbeiten zur Gewinnung aller Proteintypen im Gramm-Maßstab wurden erfolgreich beendet. Auch die Experimente zur Charakterisierung der Osborne-Fraktionen und der Proteintypen der Mehle aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer konnten abgeschlossen werden. Alle Ergebnisse sind mit vorhandenen Daten vergleichbar und die Präparate wurden anhand ihres Molekulargewichts und ihrer Aminosäuresequenz eindeutig beschrieben. Die Charakterisierung und Analyse sowohl der mikrobiellen als auch der humanen Transglutaminase-Präparate konnte ebenso abgeschlossen werden. Die Ergebnisse entsprechen den Datenbank-Einträgen und die Präparate wurden hinsichtlich ihres Molekulargewichts, ihrer Aminosäuresequenz und ihrer Aktivität eindeutig charakterisiert. Die bisherigen Versuche zur Identifizierung von Isopeptiden konzentrierten sich zunächst vorrangig auf die Methodenentwicklung sowie die Entwicklung einer Analysen- und Auswertestrategie. Es wurde eine Analysenmethode entwickelt, beruhend auf dem nanoLC-Q ExactiveTM HF Hybrid Quadrupol-Orbitrap System (Thermo Fisher). Die Auswertung der Isopeptidproben erfolgt anhand zweier Proteomics Softwares, MaxQuant und Skyline und zusätzlich manuell, um die Identifikation der Isopeptide und der Bindungsstellen zu verifizieren. Mittels dieser Strategie wurden die vier gezeigten Isopeptide und deren Bindungsstellen in den Peptidsequenzen automatisiert identifiziert. Die Auswertung der Rohdaten mit Skyline sowie die manuelle Überprüfung der Fragmentspektren erlaubte die Verifizierung der Ergebnisse. Nach Etablierung der Methoden mit mTG und PepQ wurden die abschließenden Versuche der humanen Transglutaminase und Glutenpeptiden wiederholt. Auch in diesen Proben wurden Isopeptide und deren Bindungsstellen identifiziert.
