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Projekt
Weitreichende elektrostatische Wechselwirkungen tragen zur Spezifität und Reaktivität von Proteinen der Thioredoxinfamilie bei.
Antragsteller
Privatdozent Dr. Christopher Horst Lillig
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Zellbiologie
Zellbiologie
Förderung
Förderung von 2014 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 251869040
Die reversible Oxidation und Reduktion von Proteinthiolgruppen ist ein essentieller Signaltransduktionsmechanismus. Die Enzyme der Thioredoxin-(Trx-)Familie katalysieren Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen und sind damit entscheidende Bestandteile für die Regulation durch solche sogenannten Thiolschalter. Trx-Proteine zeigen eine breite aber sehr ausgeprägte Substratspezifität - eine unabdingbare Voraussetzung für die Regulation von Redoxschaltern. Trotz vielfältiger Ansätze und Konzepte konnten die Mechanismen dieser Substratspezifität aber bis heute nicht geklärt werden. Unsere eigenen Vorarbeiten zeigten, dass thermodynamische Parameter weder mit der Spezifität, noch der Reaktivität der Redoxine korrelieren. Stattdessen fanden wir einen Zusammenhang zwischen ihrer katalytischen Effizienz und der Verteilung von elektrostatischen Feldern auf ihren Oberflächen [Chem. Sci. 6:7049-7058, 2015]. Effiziente Reaktionsgeschwindigkeiten basieren auf niedrigen Aktivierungsenergien und einer hohen Frequenz effektiver Kollisionen. Daher schlagen wir folgendes Modell vor: (1) Zuerst erkennen sich die beteiligten Proteine und richten sich aufeinander aus. (2) Die Proteine ziehen einander an. (3) Direkte molekulare Interaktionen führen zur Bildung des Encounter-Komplexes. (4) Die Thiol-Disulfid Austauschreaktion findet statt. (5) Der Komplex der Reaktionsprodukte dissoziiert. Das primäre Ziel dieses Projektes ist es, die Bedeutung spezifischer elektrostatischer Interaktionen in den frühen Phasen (1-2) der Reaktion zu klären. Insbesondere streben wir an den Beitrag dieser Kräfte zur Spezifität und zur Reaktionsgeschwindigkeit zu ermitteln. Der Schwerpunkt unserer praktischen Arbeiten wird in der biochemischen und biophysikalischen Untersuchung der Protein-Protein-Interaktionen liegen, geleitet durch Computer-basierte Analysen und Vorhersagen. Als primäre Untersuchungsmodelle schlagen wir das katalytische Disulfid der E. coli PAPS-Reduktase, den Redoxschalter im CRMP2 Protein und weitere, durch Kooperationspartner im SPP 1710 Konsortium eingebrachte, Redoxschalter vor. Wir werden die elektrostatischen Parameter auf Basis experimentell-ermittelter und modellierter Strukturen berechnen. Auf dieser Basis werden wir die Interaktionen mittels Enzymkinetik, Fluoreszenz-Quenching-Spketroskopie, Surface-Plasmonresonanz-Spektroskopie und atomarer Kraft-Spektroskopie analysieren. Wir werden die Beiträge der Assoziationsraten der Komplexbildung zur Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen. Darüber hinaus streben wir an die Spezifität der Proteine gezielt zu manipulieren. So streben wir z.B. an E. coli Grx3 in ein effizientes Reduktionsmittel der PAPS-Reduktase zu verwandeln und den Elektronentransfer zwischen Glutaredoxinen und den roGFP Redoxsensoren zu optimieren. Wir sind überzeugt, dass das Verständnis der molekularen Mechanismen der Substratspezifität der Proteine der Trx-Familie ein Schlüssel zum Verständnis der Regulation durch Thiolschalter ist.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
