Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das konfokale Laserscanningmikroskop ist seit seiner Beschaffung im August 2014 zentral in alle unsere Arbeiten sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae und in Escherichia coli eingebunden. In Kürze nur die wichtigsten Ergebnisse, die mit Hilfe dieses Gerätes erhalten und bereits publiziert wurden. Eine große zentrale Frage in meinem Forschungsgebiet ist, welche Rolle(n) der in Eukaryonten hochkonservierte Chaperon-Komplex NAC (nascent polypeptide-associated complex) in der zellulären Proteostase spielt. NAC bindet transient ans Ribosom und ist mit naszierenden Polypeptidketten quervernetzbar. Über zwei Jahrzehnte hinweg war aber ungeklärt, welche Funktion NAC nun tatsächlich ausübt. Durch Analysen von GFP-gekoppelten Modellproteinen in C. elegans mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie haben wir in vivo gezeigt, dass Ribosomen-assoziiertes NAC eine essenzielle Rolle bei der korrekten Sortierung von neu synthetisierten Proteinen in der Zelle hat. NAC bindet am Tunnelausgang des Ribosoms und verhindert so die unspezifische Assoziation von Ribosomen mit dem ER-Translokon. Fehlt NAC, so kommt es zum Fehlimport von mitochondrialen Proteinen ins Endoplasmatische Retikulum (ER). Das löst Stress im ER und in Mitochondrien aus und führt zu einer um 50% verkürzten Lebensspanne dieser Tiere. Ssb ist ein Hsp70-Chaperon in der Hefe und bindet ebenfalls, genau wie NAC, transient an Ribosomen. Völlig unverstanden war bislang, wie es das tut. Ssb gleicht auf den ersten Blick anderen Hsp70, die keine direkte Binding an Ribosomen zeigen. In aufwendigen Struktur-Funktionsanalysen haben wir mehrere Kontaktpunkte in der Substratbindedomäne von Ssb identifiziert, die für die Ribosomenbindung kritisch sind. Zusätzlich spielt das Co-Chaperon RAC eine weitere wichtige Rolle, um Ssb am Ribosom zu positionieren. In dieser Studie, zusammen mit Judith Frydman, Matthias P. Mayer und Christine Peter, wurden mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie umfangreiche in vivo-Lokalisationsexperimente mit GFP-markierten Ssb Wildtyp- und Mutanten-Proteinen durchgeführt. Zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen stehen im Zusammenhang mit Proteinfaltungsdefekten, z.B die Parkinson-Erkrankung, die durch aggregierendes alpha-Synuclein-Protein ausgelöst wird. Einige Chaperone können in diesen Aggregationsprozess eingreifen oder ihn sogar revertieren. Völlig unklar war bislang, ob NAC eine solche Funktion besitzt. In einer Studie zusammen mit Sheena Radford (University of Leeds) haben wir transgene C. elegans-Tiere, die fluoreszenzmarkiertes alpha- Synuclein produzieren, mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie analysiert. Die Depletion von NAC führte zur deutlichen Verstärkung der Aggregation von alpha-"Synuclein. Demnach ist NAC direkt oder indirekt wichtig, um alpha-Synuclein in den Zellen löslich zu halten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2015) The principle of antagonism ensures protein targeting specificity at the endoplasmic reticulum. Science 348, 201-207
Gamerdinger, M., Hanebuth, M.A., Frickey, T., and Deuerling, E.
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(2016) Multivalent contacts of the Hsp70 Ssb contribute to its architecture on ribosomes and nascent chain interaction. Nat. Commun.
Hanebuth, M.A., Kityk, R., Fries, S.J., Jain, A., Kriel, A., Albanese, V., Frickey, T., Peter, C., Mayer, M.P., Frydman, J., and Deuerling, E.
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(2018) Conformational flexibility within the nascent polypeptideassociated complex enables its interactions with structurally diverse client proteins. J. Biol. Chem. 293, 8554-8568
Martin, E.M., Jackson, M.P., Gamerdinger, M., Gense, K., Karamanos, T.K., Humes, J.R., Deuerling, E., Ashcroft, A.E., and Radford, S.E.
