Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit integriertem FLIM-Modul
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die federführende Arbeitsgruppe nutzt das bewilligte konfokale Laser-Scanning-Mikroskop mit integriertem FLIM-Modul insbesondere im Rahmen verschiedener Projekte der vaskulären Grundlagenforschung und fokussiert dabei auf Faktoren, die die Funktion von vaskulären Endothelzellen, die Gefäßneubildung und die Atherosklerose beeinflussen. Das bewilligte Mikroskop wird unter anderem verwendet, um die Signaltransduktion, Morphologie, Adhäsion und Migration sowie die Kapillarröhrenbildung und das angiogenetische Sprouting von isolierten lebenden humanen vaskulären Endothelzellen bzw. glatten Gefäßmuskelzellen mit Hilfe der integrierten Lebendzellfunktionen des Systems sichtbar zu machen und zu untersuchen. Hierbei hat sich insbesondere auch das leistungsfähige Autofokus-System des Geräts bewährt, um die Fokusebene während längerer Analysezeiten konstant zu halten. Intensitätsbasierte FRET-Verfahren sowie die FLIM-Erweiterung des Systems werden intensiv genutzt, um i) die spatio-temporale Aktivierungscharakteristik zellulärer Signalwege mit Hilfe FRET-basierter Biosensoren zu analysieren und ii) um Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Nutzung des Geräts wird nachfolgend projektbezogen näher beschrieben. In einem DFG-geförderten Projekt haben wir mit Hilfe des bewilligten Geräts den Einfluss des endothelialen AT2-Rezeptors auf die Monozyten-Endothel-Interaktion untersucht. Diese Untersuchungen legen nahe, dass AT2-Rezeptor-Überexpression in humanen Endothelzellen (EA.hy926-Zelllinie) ligandenunabhängig die TNFα-vermittelte Monozyten-Endothel-Interaktion durch Induktion der microRNA hsa-miR-126 und nachfolgende Reduktion der endothelialen VCAM1- sowie ICAM1-Expression reduziert und so anti-entzündliche Effekte ausüben kann. Weiterhin war ein antagonistischer Effekt des AT2-Rezeptors auf die AT1-Rezeptor-vermittelte Monozyten-Endothel-Interaktion zu beobachten. In diesem Zusammenhang konnten wir mit Hilfe von FRET-Mikroskopie und Immunopräzipitationsanalysen bestätigen, dass der AT2-Rezeptor Heterodimere mit dem AT1-Rezeptor ausbildet und so möglicherweise einen direkten Einfluss auf AT1-Rezeptor-vermittelte Signale nehmen kann. In einem weiteren Projekt untersuchen wir den Einfluss von Isoprostanen auf das angiogenetische Potential humaner Endothelzellen. Hierbei können wir zeigen, dass die antiangiogenetischen Signale von Isoprostanen in humanen Endothelzellen über den Thromboxan A 2-Rezeptor vermittelt werden und mit einer funktionell relevanten Aktivierung des Rho / Rho Kinase-Signalwegs einhergehen. Des Weiteren nutzen wir das bewilligte Gerät, um genetische Einflüsse auf die subzelluläre Verteilung und die Effluxfunktion des Arzneimitteltransporters ABCG2 zu analysieren. So konnten wir unter anderem zeigen, dass der häufig vorkommende ABCG2-Genpolymorphismus Q141K zu einer Reduktion der ABCG2-Expression in HEK293-Zellen führte, während die subzelluläre Verteilung des Transporters nicht signifikant verändert wurde. In diesem Zusammenhang wurde zudem deutlich, dass der Q141K- Polymorphismus die MicroRNA-vermittelte Repression der ABCG2-Expression wesentlich verstärkt. In weiteren Analysen konnten wir nachweisen, dass der F489L-Polymorphismus ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion der ABCG2-Expression in HEK293-Zellen beiträgt, ohne allerdings die betont membranständige Lokalisation des Transporters zu verändern. Zudem konnten wir beobachten, dass der F489L- Polymorphismus den inhibitorischen Einfluss von verschiedenen AT1-Rezeptor-Antagonisten auf die Effluxfunktion des Transporters verstärkte, so dass Menschen mit diesem Genpolymorphismus ein erhöhtes Risiko für AT1-Rezeptor-Antagonisten-induzierte Arzneimittelwechselwirkungen haben könnten. Letztlich hat das bewilligte Gerät wesentlich zur wissenschaftlichen Vernetzung der federführenden Arbeitsgruppe an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg beigetragen. So wird das Mikroskop in einem durch die ESF Graduate School AGRIPOLY geförderten Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe Biomedizinische Materialien des Instituts für Pharmazie für die morphologische und funktionelle Charakterisierung von kultivierten iPS-Zellen eingesetzt. Zusätzlich kommt das bewilligte Mikroskop in aktuellen Kooperationen mit der medizinischen Physiologie sowie mit den Arbeitsgruppen Medizinische Chemie und Pharmazeutische Technologie des Instituts für Pharmazie zur Anwendung. Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass die Anschaffung des Geräts die lebenswissenschaftlich ausgerichtete Forschung am Institut für Pharmazie sowie fakultätsübergreifend an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg erheblich verstärkt hat.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The C421A (Q141K) polymorphism enhances the 3'-untranslated region (3'- UTR)-dependent regulation of ATP-binding cassette transporter ABCG2. Biochem Pharmacol. 2016; 104:139-47
Ripperger A, Benndorf RA
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Generation of Cardiomyocytes From Vascular Adventitia- Resident Stem Cells. Circ Res. 2018; 123:686-699
Mekala SR, Wörsdörfer P, Bauer J, Stoll O, Wagner N, Reeh L, Loew K, Eckner G, Kwok CK, Wischmeyer E, Dickinson ME, Schulze H, Stegner D, Benndorf RA, Edenhofer F, Pfeiffer V, Kuerten S, Frantz S, Ergün S
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Pharmacogenetic Aspects of the Interaction of AT1 Receptor Antagonists With ATP-Binding Cassette Transporter ABCG2. Front Pharmacol. 2018;9:463
Ripperger A, Krischer A, Robaa D, Sippl W, Benndorf RA
