Konfokales inverses Laser-Scanning Mikroskop
Final Report Abstract
Das konfokale, inverse Laser-Scanning Mikroskop ist in verschiedenen Forschungsprojekten der Antragsteller eingesetzt worden. In den folgenden Projekten liegen bereits Publikationen vor: In der Arbeitsgruppe Mootz wurde ein neues Konzept entwickelt, um semisynthetische, zyklische Peptide per Oberflächen-Display auf Escherichia coli-Zellen zu präsentieren. Mit Hilfe von Protein-trans-Spleißen durch ein gespaltenes Intein wurde dabei ein synthetisches Polypeptid mit einem genetisch kodierten Protein, das in der äußeren bakteriellen Membran verankert war, verknüpft. Auf diese Weise werden sich generell auch chemisch modifizierte Proteine darstellen lassen. So wurden die mit einem synthetischen Fluorophor modifizierten E. coli-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Die neue Methode hat großes Potential für die Entwicklung neuer Inhibitoren auf Peptidbasis und die Funktionsanalyse modifizierter Proteine. Die Arbeitsgruppe Klempnauer hat das konfokale Laserscan-Mikroskop für Studien zur Regulation des Zellzyklus eingesetzt. In diesen Arbeiten wurde die Phosphorylierung und die dadurch ausgelöste Änderung der Konformation des essentiellen Zellzyklusregulators B-Myb untersucht. So konnte zum Beispiel durch mikroskopische Analysen nachgewiesen werden, dass der Funktionsverlust des B-Myb Proteins dazu führt, dass die Zellen nicht mehr in der Lage sind, die Zellteilung korrekt abzuschließen. Dies führt u.a. zum Auftreten von binukleären Zellen (d.h. Zellen mit zwei Zellkernen). Die Arbeitsgruppe konnte auch nachweisen, dass das B-Myb Protein eine Rolle bei der Reparatur von sog. DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. U.a. wurden mittels des konfokalen Laserscan-Mikroskops geschädigte Bereiche im Zellkern bestrahlter Zellen lokalisiert und erstmals gezeigt, dass sich das B-Myb Protein in diesen Bereichen konzentriert. In der Arbeitsgruppe Rentmeister wurden die in dem Projekt Engineering RNA-binding proteins and RNA-modifying enzymes to visualize mRNA localization in living cells erzielten Forschungsergebnisse veröffentlicht. Die 5′‐Kappe ist ein Charakteristikum eukaryotischer mRNAs und nimmt im RNA-Metabolismus entscheidende Rollen ein, die sich von der Qualitätskontrolle über den Export bis hin zur Translation erstrecken. Die Modifizierung der 5′‐Kappe könnte daher die Modulierung dieser Prozesse und die Erforschung verschiedener biologischer Funktionen ermöglichen. Wir konnten einen direkten Ansatz zur Erzeugung einer Auswahl N7-modifizierter Kappen basierend auf der hoch promiskuitiven Methyltransferase Ecm1 entwickeln und zeigen, dass diese sowie N2- modifizierte 5′‐Kappen zur Steuerung der Translation entsprechender mRNAs in vitro und in Zellen genutzt werden können. Entsprechende Modifikationen ermöglichen die anschließende Anwendung bioorthogonaler Reaktionen, z. B. die intrazelluläre Markierung einer Ziel-mRNA in lebenden Zellen. Die effiziente und vielseitige Manipulierung des N7- Atoms der mRNA-Kappe ist ein wertvoller Beitrag zum Methodenrepertoire der chemischen Biologie. Sowohl für die Überprüfung der Translation von fluoreszierenden Reporterproteinen als auch für die Visualisierung der mRNA durch Klick-Chemie in der Zelle wurde das CLSM verwendet.
Publications
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(2016): Modifying the 5'-Cap for Click Reactions of Eukaryotic mRNA and To Tune Translation Efficiency in Living Cells. Angew. Chem. Int Ed., 55, 10899–10903
Holstein, Josephin M.; Anhäuser, Lea; Rentmeister, Andrea
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(2018): Activation of the 10 oncogenic transcription factor B-Myb via multisite phosphorylation and prolyl cis/trans isomerization. Nucl. Acid Res.
Werwein, Eugen; Cibis, Hannah; Hess, Daniel; Klempnauer, Karl-Heinz
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(2018): Bacterial Cell-Surface Display of Semisynthetic Cyclic Peptides. Chembiochem, published online
Palei, Shubhendu; Becher, Kira S.; Nienberg, Christian; Jose, Joachim; Mootz, Henning D.
