STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das beschaffte STED (Stimulated Emission Depletion) Mikroskop ist ein Lichtmikroskop, das es erlaubt Strukturen mit einer Auflösung von bis zu 30 nm abzubilden. Damit ist seine Auflösung in der Fläche ca. 70-mal besser als die eines konventionellen Lichtmikroskops, das eine Auflösung von etwa 250 nm erreicht. Die höhere Auflösung erlaubt die Separierung kleiner Strukturen mit kurzen Abständen zueinander und deren präzisere Größenbestimmung. In unseren Projekten wurde das Mikroskop genutzt, um einen Typus von zellulärer Struktur in der Zellmembran zu untersuchen. Dabei handelt es sich um spezialisierte Domänen, die mit einer oder mehrerer Arten von Proteinen angereichert sind. Die Proteinzusammenballungen sind in der Regel kleiner als 100 nm. Abhängig von der Menge des vorhandenen Proteins können sie so zahlreich sein, dass ihre Abstände kleiner werden als die Auflösungsgrenze eines konventionellen Lichtmikroskops, wodurch ihre Anzahl nicht mehr aufgelöst werden kann. Das STED Mikroskop erlaubt die Bestimmung der Anzahl und der Größe dieser Domänen, wodurch Aussagen über die Packungsdichte der Proteine innerhalb der Domänen gemacht werden können. In einer Arbeit haben wir untersucht, wie die Ionenkonzentration den Oligomerisierungsgrad eines Proteins in der Zellmembran beeinflusst. Wir konnten zeigen, dass der sekundäre Botenstoff Kalzium, der selbst positiv geladen ist, die Anzahl von Domänen eines stark negativ geladenen Proteins halbiert aber nicht deren Größe verändert. Dies suggeriert eine Kalzium-regulierte Erhöhung der Packungsdichte und demnach des Oligomerisierungsgrades. In einer anderen Studie wurde mittels STED Mikroskopie untersucht, wie Proteincluster-Größe und Anzahl von den verschiedenen Segmenten des darin angereicherten Proteins abhängen. Wir fanden heraus, dass das Transmembransegment für die Bildung loser Domänen verantwortlich ist, wogegen ein bestimmter zytoplasmatischer Teil eine hohe Packungsdichte bewirkt. In einer weiteren Studie wurden die Proteinzusammenballungen des Amyloid Precursor Proteins (APP) untersucht. Hier stand die Frage im Mittelpunkt, ob die APP Moleküle so dicht in der Zellmembran gepackt sind, dass sie für die Spaltung durch alpha-Sekretasen nicht mehr zugänglich sind. Das würde erklären, weshalb die APP Moleküle noch als ganze Proteine internalisiert werden, was wiederum die Bildung des neurotoxischen Abeta-Peptids durch beta- Sekretasen Spaltung zur Folge hat. Mittels Größenbestimmung durch die STED Mikroskopie konnte ein Modell des APP Clusters entwickelt werden das suggeriert, dass die Packungsdichte von APP so hoch ist, dass seine Prozessierung in der Plasmamembran wohl tatsächlich gehemmt sein sollte. In der Summe hat uns die STED Mikroskopie erlaubt besser zu verstehen, wie Proteine in der Zellmembran organisiert sind und wie der biochemische Zugang zu diesen Proteinen gesteuert wird.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2018). Packing density of the amyloid precursor protein in the cell membrane. Biophys. J. 114, 1128-1141
De Coninck, D., Schmidt, T.H., Schloetel, J.G. and Lang, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.01.009) - (2016). Concentration dependent ion-protein interaction patterns underlying protein oligomerization behaviours. Sci. Rep. 6, 24131
Batoulis, H., Schmidt, T.H., Weber, P., Schloetel, J.G., Kandt, T. and Lang, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/srep24131) - (2017). Hyperosmolarity impedes the crosspriming competence of dendritic cells in a TRIF-dependent manner. Sci. Rep. 22, 311
Popovic ZV, Embgenbroich M, Chessa F, Nordström V, Bonrouhi M, Hielscher T, Gretz N, Wang S, Mathow D, Quast T, Schloetel JG, Kolanus W, Burgdorf S, Gröne HJ
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/s41598-017-00434-y) - (2017). The packing density of a supramolecular membrane protein cluster is controlled by cytoplasmic interactions. Elife 6, e20705
Merklinger, E., Schloetel, J.G., Weber, P., Batoulis, H., Holz, S., Karnowski, N., Finke, J. and Lang, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.7554/eLife.20705.001)
