Der Krankheitskomplex Beet necrotic yellow vein virus und Beet soil borne mosaic virus an Beta vulgaris, Analyse viraler Molekularbiologie, Interaktion und Resistenzstabilität in Beta vulgaris (Molecular Benyvirus-Interactions and Evolution in Sugarbeet)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) und Beet soil borne mosaic virus (BSBMV) sind Pflanzenviren des Genus Benyvirus (Familie Benyviridae) und erzeugen Viruskrankheiten an der Zuckerrübe (Beta vulgaris). Trotz hoher Sequenzhomologie verursachen die beiden Viren unterschiedliche Symptome und weisen eine virusspezifische Wirtbesiedlung in B. vulgaris auf. Im Rahmen des Projektes wurde die virale Biologie, Interaktion sowie Resistenzstabilität beider Viren untersucht. Hierfür wurde ein reverses genetisches System für beide Viren hergestellt und in verschiedenen Wirtspflanzen etabliert. Die Entwicklung einer Strategie zur Fluoreszenzmarkierung ermöglichte die Aufklärung der Interaktion beider Viren auf zellulärer Ebene. Obwohl beide Viren als getrennte Spezies betrachtet werden, blieben die Populationen in mischinfizierten Pflanzen getrennt und besiedelten unterschiedliche Gewebebereiche („coinfection exclusion“). Diese antagonistische Interaktion verhinderte auch eine Sekundärinfektion mit BNYVV/BSBMV, wenn bereits Pflanzen mit einem der beiden Viren infiziert waren („superinfection exclusion“). Damit konnte gezeigt werden, dass die enge Verwandtschaft eine starke antagonistische Interaktion zur Folge hat. Die bislang publizierten Ergebnisse liefern erstmalig einen Einblick in die Interaktion von zwei wichtigen Vertretern aus dem Genus Benyvirus. In weiterführenden Untersuchungen wurde ein Rekombinationsnachweis zwischen beiden Spezies erbracht. Durch die Erzeugung eines hohen Selektionsdrucks in Reassortantenversuchen konnte die Bildung von chimären RNAs, bestehend aus BNYVV und BSBMV Teilfragmenten, forciert werden. Weiterhin war es möglich mit dem reversen genetischen System Genomkomponenten für die virusspezifische Symptomatik von BNYVV und BSBMV zu identifizieren. Die auf RNA2 kodierten „housekeeping genes“ sind bei beiden Viren für die Virusinfektion-und -ausbreitung essentiell. Austausche einzelner ORFs auf der RNA2 zwischen beiden Viren führten zur starken Veränderung der virusspezifischen Symptomatik in N. benthamiana. Mittels Reassortantenversuche konnte die RNA3, die bei beiden Viren den Pathogenitätsfaktor kodiert, als wichtigste Komponente für die Symptomausprägung in B. vulgaris identifiziert werden. Die BNYVV spezifische Symptomatik (Adernvergilbung und starke Seitenwurzelbildung) ließ sich durch den Austausch der RNA3 im Hintergrund von BSBMV (RNA1&RNA2) hervorrufen. Hierdurch war es auch möglich spezifische Gene zu identifizieren, die nur in Gegenwart der BNYVV RNA3 induziert werden und für die starke Seitenwurzelbildung verantwortlich sind. Die publizierten Ergebnisse liefern erstmalig einen Einblick in molekularen Ursachen für die virusspezifische Symptomatik bei BNYVV und BSBMV. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die BNYVV RNA5 (P-Typ), mit dem Pathogenitätsfaktor P26, ebenso durch BSBMV transrepliziert wird und systemische Ausbreitung vermittelt. Damit konnte der experimentelle Beweis einer Verwandtschaft erbracht werden, der bisher nur auf einer hohen Sequenzhomologie von P26 zu P29 von BSBMV (RNA3) vermutet wurde. Eine weitere Zielstellung war die Erarbeitung eines besseren Verständnisses der Wirkungsweise und Dauerhaftigkeit der BNYVV Rz1 Resistenz in B. vulgaris. Mit dem reversen genetischen System war es möglich die Rz1 resistenzbrechenden Eigenschaften verschiedener Mutationen im P25 zu beweisen. Ebenso konnte erstmalig eine durch die RNA5 des BNYVV P-Typs vermittelte Resistenzüberwindung beschrieben werden. Durch die Anwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierung ließ sich der Selektionsdruck von Rz1 auf P25 erfassen und es konnte eine neue resistenzüberwindende Mutation identifiziert werden. Somit konnten mehrere Mechanismen nachgewiesen werden, wodurch die Plastizität des viralen Genoms zur Anpassung an pflanzliche Resistenzeigenschaften verdeutlicht wird. Obwohl diese Ergebnisse starke Evidenz für die Beteiligung von P25 an der Resistenzreaktion liefern, ließ sich die Rz1 Resistenz nicht überwinden, wenn im BNYVV die RNA3 von BSBMV supplementiert wurde. Genauso konnte sich BSBMV im resistenten Genotyp mit der RNA3 von BNYVV ausbreiten. Diese Ergebnisse waren sehr überraschend, da BSBMV durch Rz1 nicht erfasst wird und daher eine Resistenzüberwindung durch den RNA3 Austausch bei BNYVV erwartet wurde. Dies war jedoch erst möglich, wenn BNYVV die RNA2 von BSBMV hinzugefügt wurde. Daher kann vermutet werden, dass weitere virale Proteine an der Resistenzreaktion beteiligt sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2016). Characterization of the interaction between the Beet Necrotic Yellow Vein Virus pathogenicity factor P25 and an Auxin/indole-3-acetic acid protein from sugar beet. XVII Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, 17- 21 Juli 2016, Portland (USA)
Liebe, S., Thiel., H., Gilmer, D. und Varrelmann, M.
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(2017). Construction of a virus-Induced gene silencing system based on Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) and Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV). Dissertation Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
Mohammad, H.
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(2018). Application of reverse genetic systems to study Beet soil-borne mosaic virus and Beet necrotic yellow vein virus molecular biology, the interaction of species and their use as biotechnological tool. Dissertation Georg-August-Universität Göttingen
Laufer, M.
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2018. Biological properties of Beet soil-borne mosaic virus and Beet necrotic yellow vein virus cDNA clones produced by isothermal in vitro recombination: Insights for reassortant appearance. Virology, 518, pp.25-33
Laufer, M., Mohammad, H., Maiss, E., Richert-Pöggeler, K., Dall'Ara, M., Ratti, C., Gilmer, D., Liebe, S. and Varrelmann, M.
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2018. Fluorescent labelling of Beet necrotic yellow vein virus and Beet soil-borne mosaic virus for co-and superinfection experiments in Nicotiana benthamiana. Journal of General Virology, 99, pp.1321-1330
Laufer, M., Mohammad, H., Christ, D.S., Riedel, D., Maiss, E., Varrelmann, M. and Liebe, S.
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2018. Massive up‐regulation of LBD transcription factors and EXPANSINs highlights the regulatory programs of rhizomania disease. Molecular Plant Pathology, 19(10), pp.2333-2348
Fernando Gil, J., Liebe, S., Thiel, H., Lennefors, B.L., Kraft, T., Gilmer, D., Maiss, E., Varrelmann, M. and Savenkov, E.I.
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(2019). Application of a reverse genetic system for Beet necrotic yellow vein virus to study Rz1 resistance breaking in sugar beet. 40th Biennial ASSBT 2019 Meeting, 25 - 28 Februar 2019, Anaheim (USA)
Liebe, S., Maiss, E. und Varrelmann, M.
