Funktionalisierung von Cystinknoten-Mikroproteinen durch Kombination chemischer und rekombinanter Synthesestrategien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Zentrum des Vorhabens stand die Funktionalisierung von peptidischen Naturstoffen aus der Familie der Cystinknoten-Miniproteine und Cyclotide. Miniproteine sind in der Natur weit verbreitete Biomoleküle, die in Tier und Pflanze als hochpotente Inhibitoren mit pharmakologischer Wirkung z.B. als Hemmer von Proteasen, Ionenkanälen oder Rezeptoren vorkommen. Ziel des Vorhabens war die Integration chemisch synthetischer und molekularbiologischer Verfahren zur Produktion, Stabilisierung und Funktionalisierung von Cystinknoten-Miniproteinen. Dadurch sollen Synergieeffekte bezüglich der Syntheseökonomie erzielt, modulare Synthesekassetten für Miniproteine bereitgestellt und damit neue Wege zur Herstellung maßgeschneiderter Miniproteine für potenzielle Anwendungen in der Diagnostik und Therapie erschlossen werden. Diese Verfahren sollen direkt auf die Synthese und die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Miniproteinen angewandt werden, die neue Funktionalitäten besitzen, insbesondere medizinrelevante Zielmoleküle adressieren und als Modulatoren krankheitsrelevanter zellulärer Prozesse zum Einsatz kommen können. Cystinknoten-Miniproteine kommen in der Natur häufig in geschlossener und offenkettiger Form vor. Im Zuge dieses Vorhabens wurden neue Synthesewege entwickelt, die es nun ermöglichen, Minipoteine durch Bakterien herstellen zu lassen und anschließend auf chemisch synthetischem Weg eine Ringschlussreaktion zu bewerkstelligen. Die in diesem Vorhaben untersuchten Miniproteine weisen eine komplexe strukturelle Stabilisierung über die kovalente Verknüpfung der Aminosäureseitenkeiten von sechs Cysteinresten auf. Es wurde ein breit anwendbares Verfahren entwickelt, Miniproteine am Syntheseautomaten herzustellen und einer oxidativen Faltung zuzuführen, so dass diese in korrekt gefalteter Form in hohen Ausbeuten erhalten werden. Bei vielen Wirkstoffen ist die Potenz erhöht, wenn diese in mehrfacher Kopie in Form eines Polymers eingesetzt werden, insbesondere wenn das zu adressierende Zielmolekül selbst ein Oligomer ist oder in vielfacher Kopienzahl verankert auf der Zelloberfläche vorkommt. In diesem Vorhaben wurden zwei Verfahren entwickelt, die auf der Bereitstellung von Miniproteinen in mehrfacher Kopienzahl auf chemisch synthetisierten Strukturgerüsten beruhen. Dies sind zum einen zyklische Peptide, zum anderen Silsesquioxan Nanopartikel. Weiterführende Arbeiten werden zeigen, ob multimere Miniproteinkonjugate zu höheren biologischen Aktivitäten führen, als ihre monomeren Vorläufer. Außerdem wurden durch rationales Design und durch Anwendung evolutiver Verfahren Miniproteine entwickelt, die gezielt Zielproteine des Menschen addressieren, die von medizinischer Relevanz sind. So gelang es, einen hochaffinen und selektiven Inhibitor der humanen Mastzelltryptase zu entwickeln. Dieses Enzym spielt bei Asthmaerkrankungen eine Rolle. Außerdem wurde über die Durchmusterung von mehr als 100 Millionen zufällig erzeugter Varianten ein Miniprotein isoliert, welches das humane Enzym Matriptase-1 bindet und selektiv hemmt. Matriptase spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression, sowie bei Osteoarthritis. Ob die neu entwickelten Miniproteine als Modellmoleküle für diagnostischen oder therapeutischen Einsatz geeignet sind, werden Folgestudien zeigen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Evaluation and improvement of the properties of the novel cystine-knot microprotein McoEeTI for oral administration. Int. J. Pharm. 2007, 332, 72
M. Werle, K. Kafedjiiski, H. Kolmar, A. Bernkop-Schnürch
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Grafting of thrombopoietin-mimetic peptides into cystine knot miniproteins yields high-affinity thrombopoietin antagonists and agonists. FEBS J. 2007, 274, 86
S. Krause, H. U. Schmoldt, A. Wentzel, M. Ballmaier, K. Friedrich, H. Kolmar
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Head-to-tail cyclized cystine-knot peptides by a combined recombinant and chemical route of synthesis. ChemBioChem. 2008, 9, 33
O. Avrutina, H. U. Schmoldt, D. Gabrijelcic-Geiger, A. Wentzel, H. Frauendorf, C. P. Sommerhoff, U. Diederichsen, H. Kolmar
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Knottin cyclization: impact on structure and dynamics. BMC Structural Biology 2008, 8, 54
A. Heitz, O. Avrutina, D. L. Nguyen, U. Diederichsen, J.-F. Hernandez, J. Gracy, H. Kolmar, L. Chiche
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Application of copper(I) catalyzed azide-alkyne (3+2) cycloaddidition to the synthesis of templateassembled multivalent peptide conjugates. Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 4177
O. Avrutina, M. Empting, S. Fabritz, M. Daneschdar, H. Frauendorf, U. Diederichsen, H. Kolmar
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Biological diversity and therapeutic potential of natural and engineered cystine knot miniproteins. Curr. Opin. Pharmacol. 2009, 9, 608
H. Kolmar
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Engineered cystine knot minoproteins as potent inhibitors of human mast cell tryptase beta. J. Mol. Biol. 2010, 395, 167
C. P. Sommerhoff, O. Avrutina, H. U. Schmoldt, D. Gabrijelcic-Geiger, U. Diederichsen, H. Kolmar
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Towards click bioconjugations on cube-octameric silsesquioxane scaffolds. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 2212
S. Fabritz, D. Heyl, V. Bagutski, M. Empting, E. Rikowski, H. Frauendorf, I. Balog, W. D. Fessner, J. J. Schneider, O. Avrutina, H. Kolmar
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Natural and engineered cystine knot miniproteins for diagnostic and therapeutic applications. Curr. Pharm. Des. 2011, 17, 4329
H. Kolmar
