Funktionelle und molekularbiologische Charakterisierung von zwei TRP-Kanälen des Pansens als Kandidaten für den Transport von NH4+, Na+, K+ und Ca2+

• Antragstellerin: Professorin Dr. Friederike Stumpff
• Fachliche Zuordnung: Tiermedizin ; Anatomie und Physiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 318480266

Hepatische Enzephalopathie, niedrige Proteineffizienz beim Rind, und Ammoniakemissionen in die Umwelt mit Wirkung auf das globale Klima sind Folgen des gastrointestinalen Abbaus von Nahrungsproteinen zu Ammoniak, welches resorbiert wird und so dem fermentativen Umbau in mikrobielles Protein entgeht. Ein besseres Verständnis der Transportmechanismen für Ammoniak aus dem Gastrointestinaltrakt und insbesondere aus dem Rinderpansen scheint daher dringend.Aufbauend auf den Ergebnissen vorheriger, funktioneller Studien des nativen, ovinen und bovinen Pansenepithels, welche die Wirkung selektiver transient receptor potential (TRP) Kanalmodulatoren auf den durch Na+ und NH4+ induzierten Kurzschlussstrom belegen, wird es das primäre Ziel dieser Studie sein, die zugehörigen Transportmechanismen auf molekularer Ebene zu identifizieren. Hierfür werden zwei TRP-Kanäle des nativen Pansenepithels mit einem passenden pharmakologischen Profil in verschiedenen Modellsystemen überexprimiert, um die Permeabilität für physiologisch relevante Kationen zu ermitteln. Dabei soll insbesondere das Ammonium-(NH4+) Ion berücksichtigt werden. Mittels PCR und Western Blot soll zunächst ein Überblick über die TRP-Kanäle des bovinen Pansenepithels gewonnen werden. Zwei geeignete Kandidaten (bTRPA1 und bTRPV3) sollen vollständig sequenziert und dann in HEK 293 Zellen überexprimiert werden, um die Permeabilität für verschiedene Kationen mittels der Whole-Cell- und Einzelkanal-Konfiguration der Patch Clamp Technik zu untersuchen. Die Untersuchungen werden mit der Bestimmung der Leitfähigkeit dieser beiden Kanäle für die monovalenten Kationen NH4+, Na+ und K+ beginnen, sollen aber zur Messung der Permeabilität für Ca2+ und Mg2+ fortschreiten. Zur Identifikation erfolgreich transformierter Zellen sollen dabei die Kandidaten Gene mit grünfluoreszierendem Protein ko-exprimiert werden. An überexprimierenden Xenopus Oozyten soll durch den Einsatz doppelläufiger Mikroelektroden das Membranpotential und der pHi parallel verfolgt werden mit dem Ziel, den relativen Beitrag von NH4+ und NH3 zum Gesamtflux von Ammoniak zu ermitteln. Schließlich wird die Lokalisation der Kanalproteine im intakten Epithel mittels konfokaler Lasermikroskopie erfolgen. Die Spezifizität der verwandten Antikörper wird zuvor im Western Blot an überexprimierenden Zellen getestet.Ausgehend vom pharmakologischen Profil und der robusten Expression im nativen, bovinen Pansenepithel wird die Studie mit funktionellen Untersuchungen des bovinen Vertreters des TRPA1 beginnen, gefolgt von Untersuchungen zur Funktion des bovinen TRPV3. Bisher liegen keine Untersuchungen zur NH4+-Permeabilität von nicht-selektiven Kationenkanälen der TRP-Familie vor und es werden Erkenntnisse erhofft, die über das Verständnis der Resorption von Ammoniak aus dem Pansen hinausgehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen