Functional and molecular biological characterization of two TRP channels of the rumen as candidate proteins mediating the transport of NH4+, Na+, K+, and Ca2+
Anatomy and Physiology
Final Report Abstract
Zu den Auswirkungen der Ammoniakresorption aus dem Gastrointestinaltrakt zählen die niedrige Proteineffizienz von Nutztieren mit hoher Ausscheidung von Stickstoff, lokale und globale Umweltschäden, und Hyperammonämie bei Leberinsuffizienz. Es besteht daher Bedarf an einer Klärung der Resorptionsmechanismen über gastrointestinale Epithelien. Voruntersuchungen legten eine Beteiligung von Mitgliedern der TRP Kanalfamilie an der Resorption des NH4+ Ions aus dem Pansen nahe. Ferner wird seit vielen Jahren nach einem ruminalen Aufnahmemechanismus für Ca2+ gesucht, da eine mRNA Expression für die epithelialen Calciumkanäle TRPV5 und TRPV6 mehrfach ausgeschlossen wurde. Im Zeitraum des Antrages wurde im Pansengewebe mRNA für eine Reihe von TRP Kanälen detektiert, darunter die bovinen Homologe des TRPV3 (bTRPV3), TRPA1 (bTRPA1) und TRPV4 (bTRPV4), welche sequenziert wurden. Der bTRPV3 und der bTRPV4 wurden in HEK-293 überexprimiert, bTRPV3 zusätzlich in X. Oozyten. Mit Hilfe dieser Überexpressionssysteme konnten für diese beiden Kanäle Antikörper etabliert werden. Die Expression von mRNA für TRPA1 im Rinderpansen erwies sich hingegen als marginal; eine membranständige Überexpression des TRPA1 sowie die Etablierung von Antikörpern gelang nicht. Da zudem Ussingkammer Daten eher gegen eine funktionelle Expression von TRPA1 sprachen, wurde anders als geplant der TRPV4 näher charakterisiert. Der Nachweis von TRPV3 und TRPV4 gelang mittels qPCR und im Immunoblot. Immunhistochemisch zeigte sich eine diffuse zytosolische Färbung der Zellen des Epithels mit ausgeprägter Markierung der apikalen Membran des Stratum granulosum. Ein ähnliches apikal betontes Expressionsmuster fand sich auch an Zellkulturmodellen von Pansen und Haut sowie am porcinen Colon. Mittels Whole-Cell Patch-Clamp-Messungen an überexprimierenden HEK-293 Zellen konnte erstmals der Nachweis geführt werden, dass bTRPV3, hTRPV3 und bTRPV4 neben Na+ und K+ auch NH4+ leiten. Calciumimaging Daten belegen die Bedeutung für die Ca2+ Aufnahme. Die Leitfähigkeit des bTRPV3 für alle vier Kationen wurde durch Single-Channel-Messungen bestätigt. Messungen mittels pH sensitiven, doppellumigen Mikroelektroden an X. Oozyten belegten die Aufnahme von NH4+. Vergleichende Messungen von überexprimierenden Zellen und nativen Epithelien unter Einsatz verschiedener Agonisten mittels Patch-Clamp und Ussingkammer Technik unterstrichen die funktionelle Bedeutung für die Kationenresorption. Nach Abschluss der Arbeiten im Rahmen des Antrags gehen wir davon aus, dass insbesondere der bTRPV3 eine wesentliche Rolle bei der ruminalen Resorption von NH4+ und Ca2+ spielt mit möglicher Beteiligung des bTRPV4. Auch am porcinen Colon dürften diese beiden Kanäle an der Resorption von Kationen beteiligt sein. Futterergänzungsprodukte für Rinder auf Basis dieser Erkenntnisse werden bereits hergestellt und über eine Ausgründung der im Rahmen des Projektes ausgebildeten Doktoranden vertrieben.
Publications
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