Funktionelle und molekularbiologische Charakterisierung von zwei TRP-Kanälen des Pansens als Kandidaten für den Transport von NH4+, Na+, K+ und Ca2+
Anatomie und Physiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zu den Auswirkungen der Ammoniakresorption aus dem Gastrointestinaltrakt zählen die niedrige Proteineffizienz von Nutztieren mit hoher Ausscheidung von Stickstoff, lokale und globale Umweltschäden, und Hyperammonämie bei Leberinsuffizienz. Es besteht daher Bedarf an einer Klärung der Resorptionsmechanismen über gastrointestinale Epithelien. Voruntersuchungen legten eine Beteiligung von Mitgliedern der TRP Kanalfamilie an der Resorption des NH4+ Ions aus dem Pansen nahe. Ferner wird seit vielen Jahren nach einem ruminalen Aufnahmemechanismus für Ca2+ gesucht, da eine mRNA Expression für die epithelialen Calciumkanäle TRPV5 und TRPV6 mehrfach ausgeschlossen wurde. Im Zeitraum des Antrages wurde im Pansengewebe mRNA für eine Reihe von TRP Kanälen detektiert, darunter die bovinen Homologe des TRPV3 (bTRPV3), TRPA1 (bTRPA1) und TRPV4 (bTRPV4), welche sequenziert wurden. Der bTRPV3 und der bTRPV4 wurden in HEK-293 überexprimiert, bTRPV3 zusätzlich in X. Oozyten. Mit Hilfe dieser Überexpressionssysteme konnten für diese beiden Kanäle Antikörper etabliert werden. Die Expression von mRNA für TRPA1 im Rinderpansen erwies sich hingegen als marginal; eine membranständige Überexpression des TRPA1 sowie die Etablierung von Antikörpern gelang nicht. Da zudem Ussingkammer Daten eher gegen eine funktionelle Expression von TRPA1 sprachen, wurde anders als geplant der TRPV4 näher charakterisiert. Der Nachweis von TRPV3 und TRPV4 gelang mittels qPCR und im Immunoblot. Immunhistochemisch zeigte sich eine diffuse zytosolische Färbung der Zellen des Epithels mit ausgeprägter Markierung der apikalen Membran des Stratum granulosum. Ein ähnliches apikal betontes Expressionsmuster fand sich auch an Zellkulturmodellen von Pansen und Haut sowie am porcinen Colon. Mittels Whole-Cell Patch-Clamp-Messungen an überexprimierenden HEK-293 Zellen konnte erstmals der Nachweis geführt werden, dass bTRPV3, hTRPV3 und bTRPV4 neben Na+ und K+ auch NH4+ leiten. Calciumimaging Daten belegen die Bedeutung für die Ca2+ Aufnahme. Die Leitfähigkeit des bTRPV3 für alle vier Kationen wurde durch Single-Channel-Messungen bestätigt. Messungen mittels pH sensitiven, doppellumigen Mikroelektroden an X. Oozyten belegten die Aufnahme von NH4+. Vergleichende Messungen von überexprimierenden Zellen und nativen Epithelien unter Einsatz verschiedener Agonisten mittels Patch-Clamp und Ussingkammer Technik unterstrichen die funktionelle Bedeutung für die Kationenresorption. Nach Abschluss der Arbeiten im Rahmen des Antrags gehen wir davon aus, dass insbesondere der bTRPV3 eine wesentliche Rolle bei der ruminalen Resorption von NH4+ und Ca2+ spielt mit möglicher Beteiligung des bTRPV4. Auch am porcinen Colon dürften diese beiden Kanäle an der Resorption von Kationen beteiligt sein. Futterergänzungsprodukte für Rinder auf Basis dieser Erkenntnisse werden bereits hergestellt und über eine Ausgründung der im Rahmen des Projektes ausgebildeten Doktoranden vertrieben.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2016). "Evidence for the functional involvement of members of the TRP channel family in the uptake of Na(+) and NH4 (+) by the ruminal epithelium." Pflugers Arch 468(8): 1333-1352
Rosendahl, J., Braun, H. S., Schrapers, K. T., Martens, H. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00424-016-1835-4) - EP 2 879 662 B1: Zusammensetzung zur Linderung von Gastrointestinaltraktstörungen oder damit assoziierter systemischer Störungen von Wiederkäuern und Cameliden (8.2.2017)
Stumpff, F., Rosendahl, J., Aschenbach, J.R.
- US Patent 9693971: Compositions for alleviating gastrointetinal tract disorders or associated systemic disorders in ruminants and camelides (4.7.2017)
Stumpff, F., Rosendahl, J., Aschenbach, J.R.
- (2018). "A comparative study of ammonia transport across ruminal epithelia from Bos indicus crossbreds versus Bos taurus." Anim Sci J 89(12): 1692-1700
Rabbani, I., Braun, H. S., Akhtar, T., Liebe, F., Rosendahl, J., Grunau, M., Tietjen, U., Masood, S., Kaessmeyer, S., Gunzel, D., Rehman, H. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/asj.13107) - (2018). "The bovine TRPV3 as a pathway for the uptake of Na(+), Ca(2+), and NH4(+)." PLoS One 13(3): e0193519
Schrapers, K. T., Sponder, G., Liebe, F., Liebe, H. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193519) - (2020). "The TRPV3 channel of the bovine rumen: localization and functional characterization of a protein relevant for ruminal ammonia transport." Pflugers Arch 472(6): 693-710
Liebe, F., Liebe, H., Kaessmeyer, S., Sponder, G. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00424-020-02393-2) - (2021). "Beyond Ca(2+) signalling: the role of TRPV3 in the transport of NH4()." Pflugers Arch 473(12): 1859-1884
Liebe, H., Liebe, F., Sponder, G., Hedtrich, S. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00424-021-02616-0) - (2021). "Effects of butyrate− on ruminal Ca2+ transport: evidence for the involvement of apically expressed TRPV3 and TRPV4 channels." Pflügers Archiv - European Journal of Physiology
Liebe, F., Liebe, H., Sponder, G., Mergler, S. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00424-021-02647-7) - (2021). "The TRPA1 Agonist Cinnamaldehyde Induces the Secretion of HCO3− by the Porcine Colon." International Journal of Molecular Sciences 22(10): 5198
Manneck, D., Manz, G., Braun, H.-S., Rosendahl, J. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/ijms22105198) - (2021). "TRPV3 and TRPV4 as candidate proteins for intestinal ammonium absorption." Acta Physiol (Oxf): e13694. 1748-1716
Manneck, D., Braun, H. S., Schrapers, K. T. and Stumpff, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/apha.13694)
