Untersuchung der Wechselwirkung von p63 mit p300 und iASPP in Oozyten.

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 319849750

p63 gehört zur Familie des Tumorsuppressors p53. Trotz einer hohen Sequenzidentität zwischen beiden Proteinen, ist p63 kein typischer Tumorsuppressor. Bisher wurden zwei Funktionen für p63 identifiziert: 1) Das Protein ist hoch exprimiert in der Basalschicht von Epithelgeweben wo es an der Regulierung der Proliferation beteiligt ist und 2) es fungiert als Qualitätskontrollfaktor in Keimbahnzellen. Wir haben uns auf die Charakterisierung der Qualitätskontrollfunktion durch die längste Isoform, TAp63a, in Oozyten fokussiert. In Säugetieren beginnen Oozyten nach Abschluss der homologen Rekombination die Diktyate Arrestphase. In diesem Stadium werden die Oozyten für lange Zeit, in Menschen mehrere Dekaden, bis zur Ovulation gehalten. Während dieser Phase exprimieren Oozyten eine hohe Konzentration von TAp63a. Wir haben gezeigt, dass TAp63a in arretierten Oozyten in einer inaktiven, geschlossenen und nur dimeren Konformation vorliegt. Werden DNA Schäden detektiert, führt dies zur Phosphorylierung von TAp63a und der Bildung eines offenen und tetrameren Zustandes. Basierend auf Mutationsanalyse, SAXS Messungen u.a. haben wir ein strukturelles Modell des inhibierten Zustandes erarbeitet und gezeigt, dass es sich hierbei um einen kinetisch arretierten Zustand handelt. Aktivierung erfolgt nach einem Spring-loaded Mechanismus, der den thermodynamisch stabileren tetrameren Zustand erzeugt. Wir haben gezeigt, dass die DNA Bindungsaffinität des dimeren Zustandes 20fach geringer ist als die des tetrameren. Allerdings ist dies nur ein Teil des inhibitorischen Mechanismus. Unsere Ergebnisse zeigen zudem, dass die Interaktion mit der transkriptionellen Maschinerie inhibiert ist. Wir wollen die Wechselwirkung von p63 mit p300, untersuchen und ein Modell entwickeln, das den gesamten inhibitorischen Mechanismus quantitativ beschreibt. Zusätzlich haben wir gezeigt, dass die Aktivierung von TAp63a nach Bestrahlung mit einer geringen Dosis sehr viel langsamer erfolgt als nach Bestrahlung mit einer höheren Dosis. Da die meisten Oozyten die Bestrahlung mit einer geringen Dosis überleben, müssen sie Mechanismen haben, um aktiviertes TAp63a zu inhibieren. Zusätzlich zum Ubiquitin/Proteasom-System ist die Inhibierung durch iASPP ein wahrscheinlicher Mechanismus. In C. elegans gibt es nur einen Vertreter der p53 Familie (Cep-1) und einen Vertreter der ASPP Familie (Ce-iASPP), die beide in Keimbahnzellen exprimiert werden. Unterdrückung von Ce-iASPP mittels RNAi führt zu vermehrter Apoptose in den Keimbahnzellen, was nahelegt, dass Ce-iASPP ein negativer Regulator von Cep-1 ist und dass die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung einer ausreichenden Population von Keimbahnzellen spielt. In diesem Antrag beschreiben wir Experimente, um die Wechselwirkung von iASPP und p63 zu charakterisieren und funktionale Studien in Zusammenarbeit mit dem Labor von Xin Lu, Oxford, durchzuführen, das eine iASPP knock out Maus generiert hat.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen