Untersuchung der Wechselwirkung von p63 mit p300 und iASPP in Oozyten.
Strukturbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
P63 ist ein Homolog des Tumorsuppressors p53. Mausstudien haben allerdings gezeigt, dass p63 trotz einer hohen Sequenzidentität mit p53 andere Funktionen ausübt. So ist das Protein in der Basalschicht von Epithelgewebe exprimiert, wo es die Prozesse der Proliferation und der Differenzierung dieser Zellen steuert. Eine weitere – und wahrscheinlich die ursprüngliche Funktion der gesamten Familie – besteht in der Qualitätskontrolle in weiblichen Keimzellen. In diesen liegt p63 in einer inaktiven und nur dimeren Konformation vor. DNA Schäden, vor allem Doppelstrangbrüche, führen zur Aktivierung einer Kinasekaskade, die durch direkte Phosphorylierung p63 aus der inaktiven, dimeren in die aktive, tetramere Konformation überführt. In dieser Konformation kann das Protein an DNA binden und die Expression der pro-apoptotischen Faktoren PUMA und NOXA steuern, die zum Zelltod führen. Da die Behandlung von Krebspatienten mittels Chemotherapeutica ebenfalls zu DNA Schäden führt und dieser Prozess auch in den Eizellen stattfindet, ist die Chemotherapeutica-induzierte Aktivierung von p63 die Ursache für den Verlust der Fruchtbarkeit und den frühzeitigen Einsatz der Wechseljahre, der bei weiblichen Krebspatienten zu beobachten ist. Wir hatten in der Vergangenheit bereits gezeigt, dass die Affinität zu DNA um den Faktor 20 durch die Bildung des inaktiven Zustandes inhibiert ist. In den hier durchgeführten Experimenten haben wir die Wechselwirkung mit der transkriptionellen Maschinerie untersucht, vor allem mit p300. Dabei konnten wir zeigen, dass in dem inaktiven Zustand auch die Transaktivierungsdomäne von p63 unzugänglich ist und somit auch die Rekrutierung von p300 inhibiert ist, was eine höhere Sicherheit für das Überleben der Oozyten bedeutet. Durch weitere Untersuchungen konnten wir zeigen, dass im Gegensatz zu den beiden anderen Familienmitgliedern p53 und p73, die über jeweils 2 Unterdomänen innerhalb der Transaktivierungsdomäne verfügen, p63 nur eine einzige Transaktivierungsdomäne hat, die eine lange α-Helix bildet. Wir haben die Struktur dieser Transaktivierungsdomäne sowie der von p73 in Komplex mit der TAZ2 Domäne von p300 gelöst. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, dass die Affinität von p63 zu p300 im aktivierten Zustand bereits sehr hoch ist und keine weiteren posttranslationalen Modifikationen benötigt. Im Gegensatz dazu ist die Affinität von p73 an die TAZ2 schwach. Durch Sequenz-Austausch-Experimente konnten wir zudem zeigen, dass der Unterschied in der Affinität zwischen beiden Proteinen sich auf die p63 Aminosäuren 8-15 eingrenzen läßt. Ein Austausch der ersten beiden Exons zwischen p63 und p73 führt zudem zu einer geschlossenen, dimeren Konformation von p73 und zu einer offenen, tetrameren Konformation von p63. Weitere Untersuchungen fokusierten sich auf die Charakerisierung weiterer p63 N-termini (TA* und GTA), von denen wir zeigen konnten, dass sie den inaktiven Zustand weiter stabilisieren. Neben p300 haben wir auch die Interaktion mit dem Protein iASPP untersucht. iASPP bindet an eine Sequenz von p63, die sich zwischen der DBD und der OD befindet. Wir haben die Struktur des Komplexes gelöst und die Wechselwirkung quantitativ untersucht. Im Gegensatz zu anderen Interaktionspartnern ist die Affinität zu p63 eher schwach. Verdrängungsassays von der DNA waren nicht erfolgreich, so dass im Augenblick die Frage der Funktionalität der Wechselwirkung zwischen p63 und iASPP unbeantwortet bleibt. Zeitgleich haben wir aber festgestellt, dass iASPP mit einem Mitglied der AP-1 Transkriptionsfaktorfamilie wechselwirkt und Fosl1 selektiv an der Bindung an DNA inhibieren kann. Diese Wechselwikung scheint funktional wichtig, da unsere Kollaborationspartner in Oxford zeigen konnten, dass ein knockput von iASPP zu einer erhöhten Expression von AP-1 regulierten Genen führt. Dieser Zusammenhang wird jetzt genauer untersucht werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2018) Regulation of the activity in the p53 family depends on the organization of the transactivation domain. Structure 26:1091-1100
Krauskopf K, Gebel J, Kazemi S, Tuppi M, Löhr F, Schäfer B, Koch J, Güntert P, Dötsch V, Kehrloesser S
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(2019) Deletions and loss-of-function variants in TP63 associated with orofacial clefting. Eur J Hum Genet. 27:1101-1112
Khandelwal KD, van den Boogaard MH, Mehrem SL, Gebel J, Fagerberg C, van Beusekom E, van Binsbergen E, Topaloglu O, Steehouwer M, Gilissen C, Ishorst N, van Rooij IALM, Roeleveld N, Christensen K, Schoenaers J, Bergé S, Murray JC, Hens G, Devriendt K, Ludwig KU, Mangold E, Hoischen A, Zhou H, Dötsch V, Carels CEL, van Bokhoven H
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(2019) TA*p63 and GTAp63 achieve tighter transcriptional regulation in quality control by converting an inhibitory element into an additional transactivation domain. Cell Death & Disease 10(10):686
Pitzius S, Osterburg C, Gebel J, Tascher G, Schäfer B, Zhou H, Münch C, Dötsch V.
