Fluoreszenztechniken zur Kernstrukturdetektion in der Proteinfaltung
Biophysik
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In dem Projekt wurde die DBO-basierte Fluoreszenzresonanzenergietransfer- (FRET-) Methode weiterentwickelt und ihre Anwendbarkeit auf Fragen der Proteinfaltung untersucht. Wird DBO als Akzeptor verwendet mit Tryptophan (Trp), Fluorotryptophan (FTrp), Naphtyalanin (NAla) oder Tyrosin (Tyr) als Donor, sind die Förster Radien klein (Trp, FTrp, Nala: 10 Å; Tyr: 7Å). Dies macht „short distance FRET“ oder „sdFRET“, wie wir die Methode nennen, vorzüglich geeignet, um zu verfolgen, wie Diffusion zwischen Donor und Akzeptor in einem fluoreszenzmarkierten Peptid oder Makromolekül den Energietransfer verstärkt. Im Grunde können solche Messungen die Donor-Akzeptorabstandsverteilung in einer Peptidkette oder einem Protein liefern, zugleich auch den Diffusionskoeffizienten zwischen den markierten Positionen; dies bedarf jedoch einer globalen Analyse, die bisher auf der Haas-Steinberg Gleichung (HSE) basierte. Die HSE ist eine partielle Differentialgleichung zweiter Ordnung mit konstanten Koeffizienten, die nur mit numerischen Methoden gelöst werden kann. Die Analyse ist zeitaufwendig, und aufgrund ihrer Intransparenz ist oftmals nicht klar, ob wirklich genug experimentelle Informationen eingespeist wurden, um Abstandsverteilung und Diffusionskoeffizient hinreichend festzulegen. Es gelang uns, aus der HSE die „HSJ“ abzuleiten, eine geschlossene analytische Gleichung. Hierbei war entscheidend, den „erweiterten“ Diffusionskoeffizienten J zu identifizieren, der aus dem gesuchten Diffusionskoeffizienten D und drei weiteren photophysikalischen Faktoren aufgebaut ist. Wie zuvor die HSE, konnten wir jetzt die HSJ einsetzen, zur globalen Analyse 48 experimenteller Datensätze zu einem 14-mer Peptid. Was zuvor in Matlab wenigstens 15 Minuten pro Durchlauf dauerte, gelang mit der HSJ in Excel und mit dem Excel Solver in 15 Sekunden. Wir konnten durch die gewonnene Transparenz auch sicherstellen, einen genügend großen Bereich des Diffusionseinflusses abgedeckt zu haben, um Abstandsverteilung und Diffusionskoeffizient robust zu erhalten. Die Formulierung der HSJ-Gleichung reflektiert einen stufenweisen Erkenntnisgewinn aus vorherigen Arbeiten in der ersten Projektphase. So unterstützten uns Erkenntnisse aus HSE Simulationen in der Ableitung der CSA, der „confluence sphere approximation“: Es gab in der Literatur zur Dynamik unterschiedlich langer Peptidketten unterschiedliche Resultate verschiedener Forschungsgruppen, die verschiedene Fluoreszenzlöschungsmethoden (Collisional Quenching, CQ) angewendet haben. Hier konnten wir aufzeigen inwiefern sdFRET und CQ Methoden verwandt sind und ein Modell ableiten, in dem diese Widersprüche aufgehoben wurden. In einem weiteren zentralen Projekt ging es um die Überprüfung der „long-loop“ Hypothese, die von Haas formuliert worden war. Diese Hypothese besagt, dass es entlang der Aminosäurekette eines globulären Proteins weitauseinanderliegende kurze Erkennungssequenzen, „Loopschlüsse“ gibt, die sich während der Faltung zügig erkennen und ein Loopschloss und damit einen langen Loop bilden. Die Topologie des Proteins ist damit schon grob festgelegt und viele sonst mögliche Fehlfaltungswege sind ausgeschlossen. Wir haben eine neuartige Kontaktkartierung entwickelt, die es uns erlaubt, aussichtsreiche Erkennungssequenzen aus der bekannten Struktur des nativen Proteins abzuleiten. Diese identifizierten Loopschlüsse wurden in synthetischen Peptiden durch eine lange hydrophile Sequenz aus Glycin-Serin Resten verbunden. Mittels sdFRET und CD-Spektroskopie konnten wir starke Hinweise erhalten, dass in diesen Peptiden der Loop geschlossen ist, auch wenn das Loopschloss nicht notwendigerweise in einer nativ-gleichen Konformation vorliegt. In einem weiteren Teilprojekt ging es um die Anwendung und weitere Entwicklung einer Drucksprungapparatur, die an der Bar-Ilan Universität gebaut und während der Laufzeit des Projektes nach Deutschland umgesiedelt wurde.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- “Two Orders of Magnitude Variation of Diffusion-Enhanced Förster Resonance Energy Transfer in Polypeptide Chains” Polymers 2018, 10, 1079 -1084
Jacob, M.H.; Ghosh, I.; D’Souza, R.N.; Nau, W.M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/polym10101079) - „Method- Unifying View of Loop-Formation Kinetics in Peptide and Protein Folding“ J. Phys. Chem. B 2018, 122, 4445–4456
Jacob, M.H.; D’Souza, R.N.; Schwarzlose, T.; Wang, X.; Huang, F.; Haas, E.; Nau, W.M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.8b00879)
