Verständnis der Signalweitergabe durch den 'striatin interacting phosphatase and kinase' (STRIPAK) Komplex im Verlauf der eukaryotischen Entwicklung

• Antragsteller: Professor Dr. Ulrich Kück; Professor Dr. Albert Sickmann
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen ; Zell- und Entwicklungsbiologie der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 321675624

Der “Striatin-interacting phosphatase and kinase (STRIPAK) complex” ist eine supramolekulare Struktur, die evolutionär konserviert innerhalb der Eukaryoten ist. Molekulargenetische Analysen haben deutlich gemacht, dass verschiedenste Prozesse durch diesen Komplex gesteuert werden. Hierzu gehört die Zellproliferation und –differenzierung bei Säugern, der Autophagosomentransport in Drosphila-Neuronen, die Lebensfähigkeit von Caenorhabditis elegans-Embryonen oder die Zellfusion und Fruchtkörperbildung in mikrobiellen Systemen. Außerdem haben medizinische Untersuchungen gezeigt, dass Fehlregulationen des STRIPAK-Komplexes mit menschlichen Krankheiten wie z. B. Krebs korreliert sind. Vor kurzem konnte außerdem gezeigt werden, dass der STRIPAK-Komplex der Regulator und Mediator verschiedener Signal¬transduktionswege ist, dies schließt den Hippo-Signaltransduktionsweg in Drosophila, das „septation initiation network“ (SIN) in pilzlichen Systemen oder auch MAP-Kinase-Signalwege in verschiedenen Eukaryoten ein. Allerdings sind die genauen Ziele der Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch STRIPAK-assoziierte Kinasen und Phosphatasen noch nicht identifiziert. Wir haben in der Vergangenheit den Hyphenpilz S. macrospora als Modell für die Untersuchung der eukaryotischen multizellulären Entwicklung entwickelt. Die molekulare Analyse von Mutanten dieses Pilzes, die Defekte bei der Hyphenfusion und Fruchtkörperbildung aufweisen, führte zur Identifizierung von Untereinheiten eines STRIPAK-Komplexes. Unser Ziel ist, die regulatorischen Mechanismen molekular zu verstehen, die durch den STRIPAK-Komplex initiiert werden. In unsere Untersuchung sind Mutanten eingeschlossen, denen eine oder mehrere Untereinheiten des STRIPAK-Komplexes fehlen. Dies bedeutet u. a., dass wir spezifische Phosphorylierungsstellen von Zielproteinen, die differenziell in STRIPAK Mutanten phosphoryliert bzw. dephosphoryliert werden, identifizieren wollen. Wir haben dazu ein mehrstufiges Protokoll entwickelt, um Proteinextrakte in reproduzierter Art und Weise zu isolieren, insbesondere haben wir verschiedene physiologische Bedingungen getestet. Wir haben außerdem unterschiedliche Proteaseinhibitoren getestet, um die semitryptische Spaltung der Proteine zu verhindern. Dies führte dazu, dass wir die unspezifische Spaltung um 46% reduziert haben. Außerdem ist ein Protokoll für die iTRAQ-Markierung von Peptiden entwickelt worden, um zusammen mit einer 2D LC-MS/MS Methodik differenziell phosphorylierte Proteine zu identifizieren. Dies führte zur Identifizierung von 228 differenziell phosphorylierten Proteinen. In weiteren in vivo-Analysen sollen diese in S. macrospora getestet werden, um Zielproteine des STRIPAK-Komplexes zu entdecken. Unsere Untersuchungen tragen zum Verständnis der Funktion des STRIPAK-Komplexes und des damit verbundenen Mechanismus bei der zellulären Signalweitergabe bei.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen