Epigenetische Regulation der Plaqueprogression- und instabilität bei atherosklerotischen Stenosen der extracraniellen A. carotis
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unsere Vorarbeiten zeigten, dass in atherosklerotischen Plaques verschiedene epigenetische Veränderungen stattfinden, die mit dem Fortschreiten der Atherosklerose einhergehen. Insbesondere DNA- und Histon- Methylierungen weisen signifikante Modifikationen auf. Diese Daten lassen eine wichtige Rolle der Epigenetik in Atherosklerose vermuten. Das Ziel des Forschungsvorhabens lag daher in der weiteren Analyse der DNA- und Histon-Methylierung relevanter Faktoren der Atherosklerose, wie z.B. Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und einige inflammatorische Faktoren wie NFκB, IFNγ, IL-1β und TNFα. Des Weiteren waren wir an den funktionellen Zusammenhängen mit korrespondierenden epigenetischen Veränderungen interessiert. Dabei haben wir uns auf verschiedene Stadien der Atherosklerose, SMCs und Makrophagen (MΦs) fokussiert. Unsere Ergebnisse offenbarten, dass insbesondere die Expression von MMP9, MMP12 und TIMP1 in atherosklerotischen Carotidgewebe signifikant hochreguliert wurde. Diese Daten wurden auch in SMCs und Makrophagen bestätigt. Weiterhin wurde in fortgeschrittenen Stadien der Atherosklerose signifikant verringerte Expression von MMP2 beobachtet, in Makrophagen zeigte sich insbesondere MMP12 als die wichtigste Metalloproteinase. Bei DNMTs wiesen unsere Ergebnisse signifikanten Unterschiede nur bei DNMT1 auf. Diese Daten konnten auch in den primären Zellen bestätigt werden, wo insbesondere TNFα zur Verringerung der Expression von DNMT1 führte. Interessanterweise ging die Expression indirekt proportional mit dem Schweregrad der Atherosklerose einher und korrelierte zusätzlich noch mit der Expression von MMP9 und MMP12. Weiterhin wurde auch Überexpression von TET2 und 3 in LPS-stimulierten MΦs beobachtet. Von den untersuchten Histonmethyltransferasen und -demethylasen (KMTs und KDMs) zeigten lediglich KMT2C, KMT2H, KDM1A und KDM5C signifikante Steigerung der Expression in atherosklerotischen Läsionen. Interessanterweise wurden auch signifikante Zusammenhänge zwischen der Expression von MMP12 und MMP2 mit KDM1A und KMT2C entdeckt. Dies wurde auch in primären Makrophagen bestätigt, wo die Zugabe von IL-1β signifikante Verringerung der Expression von SET7 (KMT7) und KDM5 zur Folge hatte. Im Gegensatz dazu verursachte die Zufügung von LPS signifikante Erhöhung der Expression von LSD (KDM1A) und KDM5. Des Weiteren zeigte long non-coding RNAs (lncRNA) MEG3 signifikante Reduktion der Expression, die mit dem Schweregrad der Atherosklerose einherging. MEG3 induziert den TGF-β Signalweg, der eng mit der Inflammation verbunden ist. Korrelationsanalysen weisen darauf hin, dass MMP9 und MMP12 ebenfalls mit MEG3 assoziiert sind und mit KMT2C. Unsere Ergebnisse wurden partiell auch in einem atherosklerotischen Mausmodell (LDLR-/-) bestätigt. Hier zeigten SET2 (KMT3A) und SET7 (KMT7) ihre mögliche Auswirkung auf die Progression der Atherosklerose. Sie konnten als potentielle zukünftige therapeutische Ziele dienen, um z.B. die Plaqueprogression zu verlangsamen oder zu stoppen. Unsere Ergebnisse lassen folgende Schlussfolgerungen zu: (1) Es scheint, dass insbesondere MMP9 und MMP12 durch die Expression von DNMT1 signifikant beeinflusst und daher reguliert werden. (2) MMP12 scheint noch auch von der Chromatinveränderungen abhängig, weil deren Expression mit der Expression von KDM1A einhergeht. (3) MMP2 scheint robust gegenüber DNA-Methylierung zu sein, ist aber signifikant von KDM1A und KMT2C abhängig. Daher wird MMP2 Expression vielmehr von der Chromatinveränderungen beeinflusst. (4) LncRNA MEG3 korreliert mit KMT2C und kann dadurch über diese Histonmethyltransferase die Expression sowohl von MMPs als auch inflammatorischen Faktoren regulieren. (5) Aus den pro-inflammatorischen Stimuli schient insbesondere TNFα und IL-1β signifikante Rolle spielen. DNMT1 wird dabei durch TNFα herunterreguliert und IL-1β hat Reduktion von SET7 (KMT7) und KDM5 zur Folge. Weil in Atherosklerose nicht nur die DNMT1 herunterreguliert, sondern auch die Expression von DNA-Demethylasen überexprimiert wird, scheint in atherosklerotischen Läsionen allgemeine DNA-Hypomethylierung stattzufinden, die die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die Promotorenregionen erleichtert, die mRNA Transkription steigert und folglich auch die Expression verschiedener pro-atherosklerotischen Gene, wie z.B. MMPs oder inflammatorischer Faktoren. Weiterhin zeigen die exprimierten und freigesetzten Zytokine, dass sie sich gegenseitig fördern. LPS und TNFα steigern z.B. die Expression von IL-1β und NFκB, TNFα wird durch IL- 1β stimuliert. Die erhöhte Zytokinfreisetzung, verursacht unter anderem, wie unsere Daten zeigen, auch durch die Veränderung in der Epigenetik, fördert weiterhin die Inflammation. Diese Umstände führen dann zur erhöhten Expression verschiedener proteolytischen Enzyme, Degradierung der Gefässwand und Apoptose von SMCs, das am Ende zur Plaqueinstabilität und schliesslich zu einem klinischen Ereignis des z.B. ischämischen Schlaganfalls führt. Es sind noch weitere Forschungsansätze notwendig, um nicht nur die Rolle der Epigenetik in der Atherosklerose besser zu verstehen, sondern auch neue wirksame therapeutische Ansätze durch diese Erkenntnisse zu entwickeln.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Meta-Analysis of Leukocyte Diversity in Atherosclerotic Mouse Aortas. Circ Res. 2020;127(3):402-426
Zernecke A, Winkels H, Cochain C, Williams JW, Wolf D, Soehnlein O, Robbins CS, Monaco C, Park I, McNamara CA, Binder CJ, Cybulsky MI, Scipione CA, Hedrick CC, Galkina EV, Kyaw T, Ghosheh Y, Dinh HQ, Ley K
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Heterogeneity of immune cells in human atherosclerosis revealed by scRNA-Seq. Cardiovasc Res. 2021 Nov 22;117(13):2537-2543
Vallejo J, Cochain C, Zernecke A, Ley K
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Optimized High Quality DNA Extraction from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Human Atherosclerotic Lesions. J Vis Exp. 2021; (168)
Bauer S, Pauli J, Pelisek J
