Die Rolle des 5-LOX-aktivierenden Proteins während der Lipidmediatorbiosynthese und seiner Regulierung nach bakterieller Infection.

• Antragstellerin: Professorin Ulrike Garscha, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 349867953

Leukotriene (LT) sind Entzündungsmediatoren, die bei chronisch entzündlichen Erkrankungen, aber auch bei Alzheimer, Krebs und Herz-Kreislauferkrankungen eine wesentliche Rolle spielen. Der erste Schritt in der LT Biosynthese ist die Bildung des Leukotrien A4 aus Arachidonsäure (AA) durch die 5-Lipoxygenase (5-LOX). Die 5-LOX transloziert nach Aktivierung zur Kernmembran, wo das membranständige 5-LOX-aktivierende Protein (FLAP) lokalisiert ist, und die von der zytosolischen Phospholipase A2 (cPLA2) freigesetzte AA zu 5-LOX transferiert. Pharmakologische Hemmung von FLAP unterdrückt in intakten Leukozyten die Leukotrienbildung vollständig, weshalb FLAP ein interessantes Zielprotein bei Behandlung LT-vermittelter Erkrankungen darstellt. Zudem hat FLAP als pharmakologisches Target in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, da es in Zusammenhang mit kardiovaskulären Erkrankungen gebracht wurde, und eine direkte Hemmung der 5-LOX zu Nebenwirkungen führte, die einen klinischen Einsatz ausschließen. Jedoch sind die genauen Regulierungsmechanismen von FLAP in der Zelle, sowie FLAPs Rolle in der Biosynthese entzündungsauflösender Lipidmediatoren (LM) weitestgehend ungeklärt. Außerdem gibt es keine verlässlichen Daten zur Funktionalität von FLAP unter pathophysiologischen Bedingungen wie z.B. bei der bakteriellen Infektion. Ein wesentliches Ziel dieses Antrages ist es, FLAP in intakten Zellen unter pathophysiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dabei gilt es zunächst eine physiologische Stimulationsmethode (pathogene Bakterien bzw. deren Virulenzfaktoren) zu evaluieren und Bedingungen zu etablieren, die die 5-LOX aktivieren, LM Biosynthese induzieren und dabei die Viabilität der Zellen gewährleisten. Mittels Massenspektrometrie sollen dabei auch entzündungsauflösende LM untersucht werden. Durch pharmakologische Inhibition von FLAP oder knockdown des Proteins wird hier der Einfluss von FLAP auf die Biosynthese der LM erforscht. FLAP assoziiert nach Zellaktivierung mit 5-LOX was durch FLAP Inhibitoren verhindert werden kann. Teil dieses Antrages soll sein, weitere potentielle Komplexpartner wie Dicer, oder coactosin-like protein (CLP) mittels proximity-ligation assay zu identifizieren, und ihren regulierenden Einfluss auf FLAP zu untersuchen. Durch zielgerichtete Mutationen von FLAP soll die Interaktionsstelle mit 5-LOX identifiziert und charakterisiert werden. HEK293 Zellen, welche 5-LOX und FLAP bzw. seine Mutanten ko-exprimieren, werden hier sowohl für Proteininteraktionsstudien als auch für die Analyse der LM Biosynthese genutzt. Da die Aktivität der nahe verwandten LTC4-Synthase durch Phosphorylierung verringert wird, sollen potentielle Phosphorylierungsstellen an FLAP untersucht werden. Mit dem neu erlangten Wissen um die Funktionalität und Regulierung von FLAP in der LM Biosynthese nach bakterieller Infektion, dürfte es auch möglich sein neuartige Inhibitoren zu entwickeln, welche entzündlichen Prozessen effizient entgegen wirken können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen