Die Rolle des 5-LOX-aktivierenden Proteins während der Lipidmediatorbiosynthese und seiner Regulierung nach bakterieller Infection.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eine akute Entzündung ist eine körpereigene Reaktion, die durch ein komplexes Zusammenspiel vieler Prozesse gekennzeichnet ist, und gemeinhin als Immunreaktion bezeichnet wird. Im Regelfall dient sie zur Wiederherstellung des Gleichgewichtszustandes im Gewebe – der Homöostase. Gelingt dieser Prozess nicht, so können sich chronische Entzündungen entwickeln, die als Initiatoren für verschiedene Krebserkrankungen fungieren. Lipidmediatoren gehören neben Zytokinen und Peptiden zu einer Vielzahl an Signalbotenstoffen, welche diese Entzündungsprozesse initiieren, unterhalten oder auch auflösen. Im vorliegenden Projekt sollte FLAP als essentielles Hilfsprotein in der entzündlichen Leukotrienbiosynthese genauer studiert werden. Hierbei war es nötig einen pathophysiologischen Stimulus zu etablieren, um physiologische Entzündungsreaktionen besser abzubilden. Pathogene Bakterien, wie S. aureus oder E. coli sind in der Lage die LM- Biosynthese in Immunzellen zu stimulieren. Wir identifizierten die PSM (Phenol-soluble modulins) als induzierende Exotoxine des S. aureus, welche in Neutrophilen die Leukotrienbiosynthese aktivieren. Dabei stimulierten die PSM den Formylpeptidrezeptor-2 (FPR2/ALX), induzierten somit einen Kalziumeinstrom und aktivierten dadurch die Translokation der zytosolische Phospholipase A2 und der 5-LOX zur Kernmembran, wo durch das residierende FLAP die LT-Biosynthese effektiv erfolgte. Tierexperimente bestätigten die PSM-induzierte LT-Bildung. Pathogene E. coli aktivieren die LM-Biosynthese auch in Makrophagen. In diesen Immunzellen untersuchten wir nach Vorbehandlung mit verschiedenen Inhibitoren der AA-Kaskade ein breites LM-Profil. FLAP-Inhibitoren hemmten erwartungsgemäß die LT-Biosynthese, hatten aber keinen verstärkenden Einfluss auf die Bildung entzündungsauflösender LM. Außerdem entwickelten wir in Kooperation mit der Universität Innsbruck und Ankara neue duale sEH/FLAP Inhibitoren und direkte FLAP-Inhibitoren. Dabei wurde Diflapolin als erster dualer sEH/FLAP-Inhibitor in zellulären Testsystemen charakterisiert und im entzündlichen Peritonitis-Modell der Maus als potenter Inhibitor bestätigt. Diflapolin diente als Leitstruktur und so konnten in einer SAR-Studie relevante Strukturmotive identifiziert werden. Die Beobachtungen lassen darauf schließen, dass die Verbindung nur minimale Veränderungen bei Beibehaltung der inhibitorischen Aktivität zulässt. Des Weiteren wurde durch strukturund ligandenbasierte Wirkstofffindung durch die Arbeitsgruppe um Erden Banoglu 20 Verbindungen als potente FLAP-Inhibitoren vorgeschlagen. In zellulären Assays und durch den „Proximity-Ligation Assay“ konnten 4 Verbindungen als spezifische FLAP-Inhibitoren bestätigt werden. Um die Interaktionsstelle der 5-LOX mit FLAP zu identifizieren, wurden verschiedene FLAP- Mutanten generiert, in HEK_5-LOX-Zellen co-exprimiert und auf Aktivität, Hemmbarkeit durch den FLAP-Inhibitor MK886 und auf Komplexbildung mit 5-LOX untersucht. Dabei erwies sich die zweite zytosolische Schleife als mögliche Interaktionsstelle seitens FLAP. Veränderungen in dieser Schleife (Y112A, I119A S108D und S108Δ) zeigten Auswirkungen auf die Hemmbarkeit und Komplexbildung. Besonders die Aminosäure S108, welche auch als mögliche Phosphorylierungsstelle diskutiert wird scheint kritisch. Sowohl die phosphomimetische S108D Mutante, als auch die S108Δ-Mutante bildeten keinen Komplex mit 5-LOX und bestätigten das Serin als kritische Aminosäure im Leukotrienbiosynthesekomplex. Zusammenfassend erzielten wir durch diese Projektförderung die Möglichkeit FLAP als Hilfsprotein in der LT-Bildung genauer zu untersuchen. Pathophysiologische Bedingungen ermöglichen es nun die LM-Biosynthese realitätsnaher zu beforschen. Des Weiteren ist es nun möglich, durch die Identifizierung der essentiellen 5-LOX/FLAP-Interaktionsstelle passgenaue und pharmakokinetisch günstige FLAP-Inhibitoren zu entwickeln, welche chronische Entzündungsprozesse wirkungsvoll modulieren könnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Discovery of the first dual inhibitor of the 5-lipoxygenase-activating protein and soluble epoxide hydrolase using pharmacophore-based virtual screening Sci. Rep. (2017)
Garscha, U.; Romp, E.; Pace, S.; Rossi, A.; Temml, V.; Schuster, D.; König, S.; Gerstmeier, J.; Liening, S.; Werner, M.; Atze, H.; Wittmann, S.; Weinigel, C.; Rummler, S.; Scriba, G.K.; Sautebin, L.; Werz, O.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/srep42751) - Exotoxins from Staphylococcus aureus activate 5-lipoxygenase and induce leukotriene biosynthesis Cell. Mol. Life Sci. (2019)
Romp, E.; Arakandy, V.; Fischer, J.; Wolz, C.; Siegmund, A.; Löffler, B.; Tuchscherr, L.; Werz, O.; Garscha U.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00018-019-03393-x) - Synthesis, Biological Evaluation and Structure–Activity Relationships of Diflapolin Analogues as Dual sEH/FLAP Inhibitors ACS Med. Chem. Let (2019)
Vieider, L.; Romp, E.; Temml, V.; Fischer, J.; Kretzer, C.; Schoenthaler, M.; Taha, A.; Hernández-Olmos, V.; Sturm, S.; Schuster, D.; Werz, O.; Garscha, U.; Matuszczak, B.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.8b00415) - Targeting biosynthetic networks of the proinflammatory and proresolving lipid metabolome. FASEB J. (2019)
Werner, M.; Jordan, P.M.; Romp, E.; Czapka, A.; Rao, Z.; Kretzer, C.; Koeberle, A.; Garscha, U.; Pace, S.; Claesson, H.E.; Serhan, C.N.; Werz, O.; Gerstmeier, J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1096/fj.201802509r) - Discovery of Novel 5-Lipoxygenase-Activating Protein (FLAP) Inhibitors by Exploiting a Multistep Virtual Screening Protocol J. Chem. Inf. Model. (2020)
Olgac, A.; Carotti, A.; Kretzer, C.; Zergiebel, S.; Seeling, A.; Garscha, U.; Werz, O.; Macchiarulo, A.; Banoglu, E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.jcim.9b00941.s001)
