Die Modulierung der extrazellulären Matrix und die Hemmung des klonalen Überlebensvorteils von CCM3-/- Endothelzellen als neue Angriffspunkte auf dem Weg zu zielgerichteten CCM-Therapiestrategien

• Antragsteller: Professor Dr. Matthias Rath
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen ; Humangenetik
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 383067719

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) können zu Krampfanfällen, Lähmungen oder Sprachstörungen führen. Obwohl es sich bei der hereditären Form um eine seltene Erkrankung handelt, leben weltweit wahrscheinlich mehr als zwei Millionen Menschen mit einer erblichen CCM-Erkrankung. Besonders Patient*innen mit pathogenen CCM3-Varianten fallen oft mit einem frühen Manifestationsalter und einem schwereren Krankheitsverlauf auf. In Übereinstimmung mit dem 3R-Prinzip ist es in diesem Projekt gelungen, durch die CRISPR/Cas9-vermittelte CCM3-Inaktivierung in humanen Endothelzellen (ECs) bekannte Charakteristika der komplexen CCM-Pathogenese in vitro abzubilden. Zudem konnte erstmals gezeigt werden, dass die CCM3-Inaktivierung die Expression des wichtigen Matrixbestandteils Fibronektin stört. Die Supplementierung von Fibronektin normalisierte die Zellmorphologie, die Anordnung des Aktinzytoskeletts sowie die Organisation in dreidimensionalen Sphäroiden, nicht jedoch typische Genexpressionsunterschiede in CCM3-defizienten ECs. Unsere Untersuchungen rückten in Übereinstimmung mit Beobachtungen aus CCM-Mausmodellen zudem einen neuen Aspekt der Krankheitsentstehung in den Fokus des Interesses. CCMs sind keine bösartigen Tumoren. Nichtsdestotrotz zeigen unsere Ergebnisse, dass „tumorähnliche“ Mechanismen in der Krankheitsentstehung eine Rolle spielen. So zeigen CCM3-defiziente ECs eine abnorm starke Proliferation, wenn sie in Kontakt mit Wildtyp-Zellen kommen. In der Testung einer Apoptosemodulierenden Wirkstoffbibliothek wurde mit NSC59984 zudem ein bisher nur im Krebskontext beschriebener Wirkstoff identifiziert, der die abnorme Proliferation der veränderten Zellen effektiv hemmen kann. Die Projektergebnisse fügen sich damit sehr gut in den hochaktuellen Trend der internationalen Forschung zu vaskulären Malformationen, in der das Repurposing von Krebsmedikamenten intensiv als neuer Therapieansatz diskutiert wird. Da in CCMs ein Mosaik aus Zellen mit verlorener und erhaltener Expression der CCM-Gene vorliegt, sind auch die Ergebnisse unserer RNA- Sequenzierungen relevant, die zeigen, dass die beiden Zelltypen sich auch auf molekularer Ebene stark beeinflussen. Die Interaktion dieser Zellen noch besser zu verstehen, wird eine der Hauptaufgaben auf dem weiteren Weg zur Entwicklung zielgerichteter Therapiestrategien sein.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Biallelic CCM3 mutations cause a clonogenic survival advantage and endothelial cell stiffening. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 23(3), 1771-1783.
  Schwefel, Konrad; Spiegler, Stefanie; Ameling, Sabine; Much, Christiane D.; Pilz, Robin A.; Otto, Oliver; Völker, Uwe; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Cerebral Cavernous Malformations: An Update on Prevalence, Molecular Genetic Analyses, and Genetic Counselling. Molecular Syndromology, 9(2), 60-69.
  Spiegler, Stefanie; Rath, Matthias; Paperlein, Christin & Felbor, Ute
  
• CRISPR/Cas9 Genome Editing of CCM3 in Human Endothelial Cells (Poster); Gordon Research Conference - Endothelial Cell Phenotypes in Health and Disease; 15. - 20. Jul. 2018; Lucca (Barga), Italien.
  Spiegler S., Schwefel K., Ameling S., Much C.D., Pilz R.A., Otto O., Völker U., Felbor U. & Rath M.
  
• CRISPR/Cas9 Genome editing of CCM3 in human endothelial cells (Vortrag); Gordon Research Seminars - Endothelial Cell Phenotypes in Health and Disease; 14. - 15. Jul. 2018; Lucca (Barga), Italien.
  Spiegler S., Schwefel K., Ameling S., Much C.D., Pilz R.A., Otto O., Völker U., Felbor U. & Rath M.
  
• CRISPR/Cas9 vermittelte Genomeditierung von CCM3 in humanen Endothelzellen (Vortrag), Treffen Norddeutscher Humangenetiker; 17. November 2018; Hamburg, Deutschland.
  Schwefel K., Spiegler S., Ameling S., Much C.D., Pilz R., Otto O., Völker U., Felbor U. & Rath M.
  
• CRISPR/Cas9 genome editing reveals that biallelic CCM3 mutations cause a clonogenic survival advantage and endothelial cell stiffening (Poster); Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik; 06. - 08. März 2019; Weimar, Deutschland. In: medgen 2019, 31:161
  Schwefel K., Spiegler S., Ameling S., Much C.D., Pilz R.A., Otto O., Völker U., Felbor U. & Rath M.
  
• Novel Pathogenic Variants in a Cassette Exon of CCM2 in Patients With Cerebral Cavernous Malformations. Frontiers in Neurology, 10.
  Much, Christiane D.; Schwefel, Konrad; Skowronek, Dariush; Shoubash, Loay; von Podewils, Felix; Elbracht, Miriam; Spiegler, Stefanie; Kurth, Ingo; Flöel, Agnes; Schroeder, Henry W. S.; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Postzygotic mosaicism in cerebral cavernous malformation. Journal of Medical Genetics, 57(3), 212-216.
  Rath, Matthias; Pagenstecher, Axel; Hoischen, Alexander & Felbor, Ute
  
• Precise CCM1 gene correction and inactivation in patient‐derived endothelial cells: Modeling Knudson's two‐hit hypothesis in vitro. Molecular Genetics & Genomic Medicine, 7(7).
  Spiegler, Stefanie; Rath, Matthias; Much, Christiane D.; Sendtner, Barbara S. & Felbor, Ute
  
• CRISPR/Cas9-mediated Generation of Human Endothelial Cell Knockout Models of CCM Disease. Cerebral Cavernous Malformations (CCM), 169–177.
  Schwefel, Konrad; Spiegler, Stefanie; Much, Christiane D.; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Fibronectin rescues aberrant phenotype of endothelial cells lacking either CCM1, CCM2 or CCM3. The FASEB Journal, 34(7), 9018-9033.
  Schwefel, Konrad; Spiegler, Stefanie; Kirchmaier, Bettina C.; Dellweg, Patricia K. E.; Much, Christiane D.; Pané‐Farré, Jan; Strom, Tim M.; Riedel, Katharina; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• First interchromosomal insertion in a patient with cerebral and spinal cavernous malformations. Scientific Reports, 10(1).
  Pilz, Robin A.; Schwefel, Konrad; Weise, Anja; Liehr, Thomas; Demmer, Philipp; Spuler, Andreas; Spiegler, Stefanie; Gilberg, Eberhard; Hübner, Christian A.; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Structural genome variations in cerebral cavernous malformations (Interactive e-Poster); ESHG 2020.2; 06. - 09. Jun. 2020 - Virtual Conference. In: Eur. J Hum. Genet. 2020, 28 (Suppl 1):381.
  Pilz R.A., Schwefel K., Weise A., Liehr T., Demmer P., Spuler A., Spiegler S., Gilberg E., Hübner C.A., Felbor U. & Rath M.
  
• Inactivation of Cerebral Cavernous Malformation Genes Results in Accumulation of von Willebrand Factor and Redistribution of Weibel-Palade Bodies in Endothelial Cells. Frontiers in Molecular Biosciences, 8.
  Much, Christiane D.; Sendtner, Barbara S.; Schwefel, Konrad; Freund, Eric; Bekeschus, Sander; Otto, Oliver; Pagenstecher, Axel; Felbor, Ute; Rath, Matthias & Spiegler, Stefanie
  
• Cas9-Mediated Nanopore Sequencing Enables Precise Characterization of Structural Variants in CCM Genes. International Journal of Molecular Sciences, 23(24), 15639.
  Skowronek, Dariush; Pilz, Robin A.; Bonde, Loisa; Schamuhn, Ole J.; Feldmann, Janne L.; Hoffjan, Sabine; Much, Christiane D.; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Contact-dependent signaling triggers tumor-like proliferation of CCM3 knockout endothelial cells in co-culture with wild-type cells. Cellular and Molecular Life Sciences, 79(6).
  Rath, Matthias; Schwefel, Konrad; Malinverno, Matteo; Skowronek, Dariush; Leopoldi, Alexandra; Pilz, Robin A.; Biedenweg, Doreen; Bekeschus, Sander; Penninger, Josef M.; Dejana, Elisabetta & Felbor, Ute
  
• Tumor-like proliferation of CCM3 knockout endothelial cells in co-culture with wild-type cells (Poster); Seeon Angiogenesis Meeting; 17. - 20. Sep. 2022; Seeon-Seebruck, Deutschland.
  Schwefel K., Malinverno M., Pilz R.A., Skowronek D., Leopoldi A., Biedenweg D., Bekeschus S., Penninger J., Dejana E., Felbor U. & Rath M.
  
• Tumor-like proliferation of CCM3 knockout endothelial cells in co-culture with wild-type cells (Vortrag); Seeon Angiogenesis Young Investigator Meeting; 16. - 17. Sep. 2022; Seeon-Seebruck, Deutschland.
  Schwefel K., Malinverno M., Pilz R.A., Skowronek D., Leopoldi A., Biedenweg D., Bekeschus S., Penninger J., Dejana E., Felbor U. & Rath M.
  
• Using CRISPR/Cas9 genome editing in human iPSCs for deciphering the pathogenicity of a novel CCM1 transcription start site deletion. Frontiers in Molecular Biosciences, 9.
  Pilz, Robin A.; Skowronek, Dariush; Hamed, Motaz; Weise, Anja; Mangold, Elisabeth; Radbruch, Alexander; Pietsch, Torsten; Felbor, Ute & Rath, Matthias
  
• Cas9-mediated Nanopore sequencing enables precise characterization of structural variants in CCM genes (Poster); Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik; 15. - 17. März 2023; Kassel, Deutschland. Veröffentlichung in Abstract-Band: ausstehend (Nominierung für Posterpreis der GfH).
  Skowronek D., Pilz R.A., Bonde L., Schamuhn O.J., Feldmann J.L., Hoffjan S., Much C.D., Felbor U. & Rath M.
  
• Comprehensive RNA sequencing demonstrates that endothelial differentiation of CCM1 knockout iPSCs triggers a specific gene expression signature (Poster); Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik; 15. - 17. März 2023; Kassel, Deutschland. Veröffentlichung in Abstract-Band: ausstehend (Nominierung für Posterpreis der GfH).
  Pilz R.A., Skowronek D., Mellinger L., Felbor U. & Rath M.
  
• Endothelial Differentiation of CCM1 Knockout iPSCs Triggers the Establishment of a Specific Gene Expression Signature. International Journal of Molecular Sciences, 24(4), 3993.
  Pilz, Robin A.; Skowronek, Dariush; Mellinger, Lara; Bekeschus, Sander; Felbor, Ute & Rath, Matthias