Identifizierung von Peptidsequenzen und Proteindomänen des Glykoproteins Tenascin-C zur Herstellung bioaktiver Hydrogele zum Studium des Verhaltens neuraler Stamm-/ Progenitorzellen in 2D und 3D Zellexperimenten.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Zentralnervensystem (ZNS) entwickelt sich während des embryonalen und frühen postnatalen Lebens. Neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs) leben in Stammzellnischen, die aus NSPCs, von NSPCs abgeleiteten Vorläuferzellen, Stützzellen der Nische, Blutgefäßen und einer extrazellulären Matrix (ECM) bestehen. Insbesondere das komplexe ECM-Milieu ist an der Regulierung des Zentralnervensystems und der Plastizität als Reaktion auf Läsionen beteiligt. Tenascin-C (Tnc) ist in verschiedenen Stammzellnischen stark angereichert und kann als Modell für Glykoproteine von NSPC-Nischen angesehen werden. Das Ziel des Forschungsantrags bestand darin zu untersuchen, welchen Einfluss substratgebundene und lösliche Proteindomänen aber auch Peptide von Tenascin-C auf die Differenzierung, Proliferation und Migration von NSPCs haben. Dafür sollte ein synthetisches Hydrogel entwickelt werden, welches es erlaubt, ausgewählte Peptidsequenzen und Proteindomänen von Tenascin-C, alleine oder in Kombination mit weiteren funktionellen Gruppen, auf die Differenzierung, Proliferation und Migration von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen in 2D, auf der Geloberfläche und eingeschlossen im Gel (3D), zu untersuchen. Zuerst wurde mithilfe des Neurosphärenmodells untersucht, wie sich die von Tnc abgeleiteten FnIII-Domänen A1D, CD, A124BCD und 78 auf das Verhalten von NSPCs auswirken. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die A124BCD-Domäne die Differenzierung von Neuronen und Oligodendrozyten unterstützte, während die FnIII-Domäne A1D eine Astrozyten-fördernde Wirkung aufwies. Zudem zeigte die FnIII-Domäne 78 einen positiven Einfluss auf die Proliferation und Migration von NSPCs. Parallel dazu wurde versucht, die Peptide VSWRAPTA (Tnc-Peptid 1) und VFDNFVLK (Tnc-Peptid 2) in ein synthetisches Hydrogel einzubauen. Dabei erschwerten die Größe und Hydrophobizität der Peptide jedoch den Einbau in das Hydrogelsystem. Daher wurde die Hydrogelsynthese umgestellt und die Zielpeptide wurden polymeranalog über ein lösliches Präpolymer eingebracht. Diese Variante vereinfachte die Polymeranalytik und erlaubt es jetzt größere Mengen des Peptids Tnc-Peptid 1 und des Referenzpeptids GRGDSF in das Hydrogelsystem einzubauen. Da jedoch die Anwesenheit kationischer Gruppen wesentlich war für die Wasserlöslichkeit der Hydrogele und für eine Unterstützung der initialen Zelladhäsion, wurde zuerst der konzentrationsabhängige Einfluss kationischer Gruppen auf das Überleben von U251-MG Zellen untersucht. Anschließend wurden die Erkenntnisse genutzt, das Überleben, die Differenzierung und die Proliferation von NSPCs in Gegenwrt oder Abwesenheit des Wachstumsfaktors FGF2 zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten eine eindeutige Korrelation zwischen zunehmender kationischer Ladung und der Anzahl lebender Zellen und proliferierender NSPCs. Andererseits zeigten die Untersuchungen zur Differenzierung, dass mehr Neuronen auf stark kationischen Geloberflächen gefunden wurden, während mehr Astrozyten und Oligodendrozyten auf neutral oder schwach geladenen Geloberflächen gebildet wurden. Die Zugabe von FGF2 führte zu einem signifikanten Anstieg der Gesamtzahl der Zellen auf den Gelen, jedoch blieb das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen bei den meisten Gelen gleich. Zudem wurde durch die raschere Zellexpansion in Anwesenheit von FGF2 die Differenzierung der NSPC für Neuronen und Astrozyten deutlich verlangsamt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die genaue Kontrolle der kationischen Ladungskonzentration wichtig ist, um das Verhalten von NSPCs zu steuern und eröffnet damit neue Wege zur Entwicklung optimierter Biomaterialien für die Zellkultivierung.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Hydrogel Matrices und deren Anwendung in der Kultivierung von neuralen Stammzellen. Dissertationsschrift (TU Dortmund)
Nils Stamm
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Hydrogels Derivatized With Cationic Moieties or Functional Peptides as Efficient Supports for Neural Stem Cells. Frontiers in Neuroscience, 14.
Glotzbach, Kristin; Stamm, Nils; Weberskirch, Ralf & Faissner, Andreas
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Concentration Dependent Effect of Quaternary Amines on the Adhesion of U251-MG Cells. Gels, 8(12), 827.
Stamm, Nils; Glotzbach, Kristin; Faissner, Andreas & Weberskirch, Ralf
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Synthesis and Characterization of Cationic Hydrogels from Thiolated Copolymers for Independent Manipulation of Mechanical and Chemical Properties of Cell Substrates. Macromolecular Bioscience, 22(5).
Pätzold, Florian; Stamm, Nils; Kamps, Dominic; Specht, Maria; Bolduan, Patrick; Dehmelt, Leif & Weberskirch, Ralf
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Cationic Hydrogels Modulate Neural Stem and Progenitor Cell Proliferation and Differentiation Behavior in Dependence of Cationic Moiety Concentration in 2D Cell Culture. ACS Biomaterials Science & Engineering, 10(5), 3148-3163.
Glotzbach, Kristin; Stamm, Nils; Weberskirch, Ralf & Faissner, Andreas
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Substrate-bound and soluble domains of tenascin-C regulate differentiation, proliferation and migration of neural stem and progenitor cells. Frontiers in Cellular Neuroscience, 18.
Glotzbach, Kristin & Faissner, Andreas
