TRIC: Eine neue Methode zur genomweiten Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von ncRNA:DNA-Triplexen
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Rolle der nicht-codierenden RNAs (ncRNAs) als epigenetische Regulatoren ist bekannt, doch die Mechanismen, die es den ncRNAs ermöglichen, bestimmte Loci in der Chromatinlandschaft zu erkennen, werden noch immer intensiv erforscht. Die sequenzspezifische DNA- Bindung kann durch die Bildung einer Tripel-Helix (Triplex) vermittelt werden, die einen ncRNA-Abschnitt umfasst, der durch Hoogsteen-Basenpaarung an den DNA-Duplex bindet. Mehrere Studien in Zellen aus Mensch und Maus, die sich auf spezifische ncRNAs konzentrierten, haben gezeigt, dass diese ncRNAs in Triplexe eingebunden sind. Um einen direkten und unvoreingenommenen Nachweis von ncRNA:DNA-Triplexen in Zellen zu ermöglichen, hat mein Labor eine Methode zur Triplexisolierung entwickelt, die auf dem Triplex-bindenden Protein Stm1TBD basiert und als TRIC (Triplex-Recognition in Cells) bezeichnet wird. Bei der Anwendung von TRIC in NIH3T3-Fibroblasten der Maus entdeckten wir eine ncRNA:DNA- Triplex am Kras-Genpromotor und zeigten, dass es sich bei der ncRNA um ein den Promotor abdeckendes Antisense-Transkript handelt. Bemerkenswerterweise, kann die Promotorregion, die an der Triplex beteiligt ist, alternativ auch einen G-Quadruplex (G4), eine andere nicht-kanonische Nukleinsäurestruktur, ausbilden. Durch die Entwicklung des G4-Sensorproteins RG4S in Analogie zu Stm1TBD wurde in diesem Projekt die Kras-Regulierung durch das Triplex/G4-Zusammenspiel entschlüsselt. Wir fanden heraus, dass bei pharmakologischer G4-Stabilisierung ein repressiver Komplex aus den Transkriptionsfaktoren Miz1 und Myc Histondeacetylierung und Chromatinkompaktierung bewirkt. Dieser Mechanismus wird durch die Triplex-Bildung unterdrückt, die somit die Transkription ermöglicht. Bei zellulärer Seneszenz wird Kras durch die Umwandlung von Triplex in G4 herunterreguliert. Dieser Befund belegt die physiologische Bedeutung des Wechsels zwischen den Kras-Promotorstrukturen und stellt möglicherweise einen Prototyp für diese epigenetische Regulierung der Promotoraktivität dar. Um die genomweite ncRNA:DNA-Triplex-Bildung zu untersuchen, haben wir TRIC mit RNA-Sequenzierung kombiniert. Diese Experimente bestätigten Kras antisense RNA und Oxct1as, eine bereits bekannte Triplex-ncRNA, als Triplex-Komponenten. Darüber hinaus waren in den angereicherten RNAs viele Sequenzmotive mit hoher Triplex-Kompatibilität zu finden. Diese Daten bestätigten, dass TRIC für den de novo-Nachweis von zellulären Triplexen gut geeignet ist. Trotz mehrerer Versuche gelang es uns jedoch nicht, die technische Qualität der TRIC-vermittelte DNA-Isolierung ausreichend zu optimieren. Daher konnte die DNA-Sequenzierung nicht durchgeführt werden, so dass in Zukunft weitere Anpassungen erforderlich sein werden, um die gleichzeitige Identifizierung der zusammengehörenden RNA- und DNA- Komponenten von Triplexen zu ermöglichen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Epigenetic Erosion in Adult Stem Cells: Drivers and Passengers of Aging. Cells, 7(12), 237.
Kosan, Christian; Heidel, Florian H.; Godmann, Maren & Bierhoff, Holger
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RNA:DNA triple helices: from peculiar structures to pervasive chromatin regulators. Essays in Biochemistry, 65(4), 731-740.
Greifenstein, Andreas Adam; Jo, SoYoung & Bierhoff, Holger
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G-quadruplex and RNA:DNA triplex structures: Epigenetic Yin and Yang at the Kras promoter. [Conference presentation]. RNA 2023 - The 28th Annual Meeting of the RNA Society, Suntec Convention Centre, Singapore
Jo S., Greifenstein A.A., Lange L., Preckwinkel P. & Bierhoff H.
