Funktionelle Analyse des LIM-Domänen Proteins Smallish bei der Regulation des Actomyosin-Netzwerks und der Dynamik von Zellkontakten an der ZA

• Antragsteller: Professor Dr. Andreas Wodarz
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 413909300

Epitheliale Zellen sind durch eine dynamische Zell-Zell-Adhäsion gekennzeichnet, die Veränderungen der Zellform und eine Beweglichkeit der Zellen während der Morphogenese ermöglicht. Die Regulation der Zelladhäsion erfolgt am apikal gelegenen gürtelförmigen Zellkontakt, der Zonula adherens (ZA). Die Ausbildung der ZA hängt von Polaritätsregulatoren ab, die zusammen den Par-aPKC Komplex bilden. Wir haben das LIM Protein Smallish (Smash) als Bindungspartner von Bazooka/Par3 (Baz), einer Komponente des Par-aPKC-Komplexes, identifiziert. Smash bindet außerdem an Canoe/Afadin (Cno) und an die Tyrosinkinase Src42A. Smash lokalisiert an der ZA und zeigt dort eine ausgeprägte planare Polarität. Mutation von smash führt zum Verlust der planaren Zellpolarität (PCP) in der embryonalen Epidermis und zu reduzierter Spannung des kortikalen Actomyosin-Netzwerks an Zellkontakten. Daraus resultieren schwerwiegende Defekte in der Morphogenese epithelialer Gewebe und Organe. Überexpression von Smash induziert die apikale Konstriktion epithelialer Zellen. Wir postulieren daher, dass Smash ein wichtiger Regulator der Morphogenese ist, der PCP und Actomyosin-Kontraktilität an der ZA koordiniert.Im beantragten Projekt werden wir die zellulären Grundlagen des smash Phänotyps genau untersuchen, u. a. durch Lebendbeobachtung und quantitative Analyse der Dynamik von Zellkontakten und morphogenetischer Bewegungen während der Keimstreifausstreckung und der Tubulogenese des Tracheensystems. Wir werden eine klonale Analyse des smash Phänotyps in Imaginalscheiben und im Follikelepithel durchführen und werden untersuchen, welche Auswirkung die Mutation von smash auf die subzelluläre Lokalisation bekannter ZA- Proteine hat. Laser-Ablationsexperimente werden zeigen, wie sich Mutation und Überexpression von smash auf das kortikale Actomyosin-Netzwerk in der embryonalen Epidermis auswirken. Die Analyse der Lokalisation von Smash in Mutanten für Gene, deren Funktion in der epithelialen Morphogenese zuvor gezeigt wurde, werden Aufschluss über die Position von Smash im Netzwerk dieser Proteine geben. Wir werden außerdem die Dynamik der Lokalisation verschiedener Isoformen von Smash untersuchen und werden diese Daten mit der Dynamik von Aktin und Myosin II während der Morphogenese in Beziehung setzen. Um einen Überblick über die Bindungspartner von Smash zu erhalten, werden wir co-IP Experimente durchführen und die Bindungspartner durch Massenspektrometrie identifizieren. Gefundene Bindungspartner werden durch co-IP Experimente in Zellkultur sowie durch funktionelle Analysen unter Verwendung von Mutanten oder RNA-Interferenz validiert. Schließlich werden wir untersuchen, ob Smash als Kofaktor für die Kinasen Rok und Src42A agiert und deren Kinaseaktivität oder Substratspezifität beeinflusst.Insgesamt erwarten wir von diesem Projekt ein verbessertes Verständnis der Funktion von Smash, eines neuen ZA-assoziierten Proteins, das für die Morphogenese von Epithelien unerlässlich ist.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1782: Epithelial intercellular junctions as dynamic hubs to integrate forces, signals and cell behaviour