Entschlüsselung der Funktionen menschlicher "Exon-Junction Complexes"

• Antragsteller: Professor Dr. Christoph Dieterich; Professor Dr. Niels H. Gehring
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 418083979

Spleißen ist nicht nur ein essentieller Schritt bei der Reifung der meisten Pre-mRNAs in Säugerzellen, sondern führt auch zur Assemblierung und Bindung von Exon-Junction-Complexes (EJC) auf mRNAs. Der EJC regelt viele post-transkriptionelle Schritte der Genexpression, einschließlich mRNA-Lokalisierung, Translation und mRNA Abbau. Darüber hinaus beobachtet man in Zellen ohne EJCs bemerkenswerte Veränderungen beim Spleißen, ohne allerdings Einblicke in den zugrundeliegenden Mechanismus zu haben. Wir haben kürzlich entdeckt, dass EJCs das Spleißen von benachbarten exonischen Spleißstellen effizient unterdrücken können. Dazu rekrutiert der EJC den Spleißregulator RNPS1, unterdrückt die Nutzung kryptischer 5' Spleißstellen und verhindert Exon-Skipping durch Re-Spleißen (auch als rekursives Spleißen bezeichnet). Die Bindung des EJC maskiert zudem rekonstituierte 3' Spleißstellen und unterbindet die Fragmentierung von Transkripten. So schützen EJCs das Transkriptom von Säugetierzellen vor ungewolltem Verlust exonischer Sequenzen und sichern damit die Expression intakter, vollständiger mRNAs. Während unserer experimentellen Analyse haben wir festgestellt, dass EJC-abhängige Spleißveränderungen mindestens drei weitere Faktoren benötigen - RNPS1, SAP18 und PNN. Für RNPS1 existieren zwar hochwertige RNA-Seq-Daten, nicht aber für SAP18, PNN oder die EJC-Kernfaktoren (EIF4A3, RBM8A, MAGOHA&B). Deshalb planen wir RNA-Seq-Experimente mit Zellen, in denen diese Faktoren depletiert wurden, sowie einer CASC3-Knockout-Zelllinie. Wir kombinieren konventionelle Illumina-Sequenzierung mit Einzelmolekül-RNA-Sequenzierung / Einzelmolekül-PCR-cDNA-Sequenzierung auf der Nanopore-Plattform (Oxford Nanopore Technologies). Darüber hinaus wollen wir die Bedeutung von CASC3 für die mRNA-Stabilität und die mRNA-Translation mittels transkriptomweitem SLAM-Seq bzw. Ribo-Seq untersuchen. Die Kombination dieser Techniken wird es uns ermöglichen, die verschiedenen zellulären Funktionen des EJC besser zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen