Untersuchungen zur Pathogenität der IgA-Autoantikörper bei Pemphigoid Erkrankungen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Hauptziel dieses Forschungsvorhabens war die Entwicklung eines in-vivo-Mausmodells zur Simulation IgA-vermittelter blasenbildender Autoimmunerkrankungen der Haut. Dieses Vorhaben stellte eine bedeutende Herausforderung dar, da es zwar seit mehreren Jahrzehnten IgG-basierte i n vivo Modelle blasenbildender Dermatosen gibt, es allerdings bisher nie gelungen ist, ein IgA- basiertes i n vivo Modell zu etablieren. Der Grund hierfür liegt vermutlich vor allem darin, dass IgA in Mäuse eine andere Rolle spielt als im Menschen. Mäuse tragen zudem keinen IgA-Rezeptor auf der Oberfläche von Granulozyten. Wir konnten i n früheren Arbeiten zeigen, dass der Fc-Anteil eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von Immunzellen bei subepidermal blasenbildenden Autoimmundermatosen spielt.Das zweite Problem besteht darin, dass es für IgA für lange Zeit keine spezifische Methode zur einfachen Aufreinigung gab, die mit der Methode der Protein A bzw. Protein G-Affinitätschromatographie für IgG vergleichbar war. Das dritte Problem besteht darin, dass menschliche Autoantikörper gegen Strukturproteine der dermo-epidermalen Junktionszone nur unzureichend an Maushaut binden. Wir verwenden mehrere Strategien, um die genannten Probleme anzugehen. Das Problem des fehlenden IgA-Rezeptor (FcaRl) lösten wir, indem wir von einer Kooperationspartnerin eine transgene Mauslinie erhielten, die den humanen FcaRl auf Granulozyten tragen. Alternativ versuchten wir, Mäuse mit einem humanisierten Immunsystem zu erzeugen. Das Problem der fehlenden Kreuzreaktivität zwischen Autoantikörpern des Menschen mit Maushaut versuchten wir zu lösen, indem wir eine Mauslinie verwendeten, die ein Knock-out des murinen Kollagen Typ XVII in Kombination mit einem Knock-in humanen Kollagen Typ XVII hatten (mCOL17*° hCOL17'%. Diese Mäuse mussten mit den FcaRl-transgenen Mäusen gekreuzt werden, wobei schließlich auffiel, dass die adulten mCOL17°° hCOL17-Mäuse im Verlauf der Zeit Hautläsionen entwickelten, die zum einen den experimentellen Readout kompromittierten und zudem tierethische Bedenken aufwarf (Zucht belasteter Mauslinien). Wir verwarfen daher diese Strategie und konzentrierten uns auf die Herstellung spezifische IgA-Autoantikörper gegen Maushaut. Für die Herstellung spezifischer IgA-Autoantikörper verwendeten wir B-Zellen aus der Milz und dem Knochenmark von Mäusen aus dem sogenannten aktiven Mausmodell der EBA. Aus der RNA konnten wir mittels RT-PCR eine scFv-Bibliothek in M13-Phagen generieren, aus denen wir 8 Antikörper gegen murines Kollagen VII (mCOL7c) isolieren konnten. Ein Versuch einer direkten Rekonstruktion vollständiger IgA-Autoantikörper aus den scFvs m i t bereits vorher erfolgreich verwenden Vektoren schlug fehl: die Antikörper wurden nach Transfektion nicht exprimiert. Eine aufwändige Fehlersuche brachte uns letztlich zu der Entscheidung, die Antikörperkonstrukte synthetisch zu generieren, so dass wir schließlich 2 Konstrukte (B8 anti-mCOL7c hlgA1 und C10 antimCOL7c hIgA2) erzeugten, die optimal nach Transfektion exprimiert wurden und die sich u.a. in Bindungsstudien auf Maushaut und im in-vitro-Modell blasenbildender Dermatosen (ROS-Release-Assay) als biologisch aktiv erwiesen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die pathogenetische Wirkung der IgA-Autoantikörper nicht auf einer direkten Stimulation der Keratinozyten beruht. Da IgA-Antikörper auch kein Komplement aktivieren können, müssen sie über einen anderen Mechanismus bewirken, dass es zur Attraktion von Immunzellen und zu einer subepidermalen Blasenbildung kommt. Möglicherweise spielen Immunzellen, die in der Dermis und Epidermis patrouillieren, eine Schlüsselrolle, was nur in einem in vivo Modell untersucht werden kann.
