Assemblierungsstadien und Strukturen des Tat Translokons
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das twin-arginine translocation (Tat) System dient dem Transport gefalteter, häufig Cofaktorbeinhaltender Proteine über energetisierte Membranen von Bakterien, Archaeen, pflanzlichen Mitochondrien und Plastiden. Tat-abhängig transportierte Proteine werden mit einem Transport-vermittelnden N-terminalen Signalpeptid synthetisiert, welches ein sogenanntes Zwillingsargininmotiv (twin-arginine motif) beinhaltet. Der Tat-Weg ist für alle photosynthetische und viele respiratorische Redoxwege essentiell. Es ist daher nicht überraschend, dass das Tat System auch für die Virulenz vieler pathogener Bakterien benötigt wird, darunter solch wichtige Arten wie Mycobacterium tuberculosis oder Pseudomonas aeruginosa. Eine zentrale Frage der gegenwärtigen Tat-Forschung ist, wie das Tat-System mechanistisch den Transport von Proteinen erlaubt, die im Durchmesser sogar größer als Membrandicken sein können. Tat-Translokons setzen sich aus multiplen Kopien zumindest zweier verschiedener Proteine zusammen, einem der TatAB Proteinfamilie und einem TatC. Der intensiv untersuchte Modellorganismus Escherichia coli bildet aktive Tat-Translokons aus den drei Komponenten TatA, TatB und TatC, wobei TatB und TatC den sogenannten „Tat-Rezeptor“ bilden und TatA für die Permeabilisierung der Membran benötigt wird. Mittels blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) können drei substratfreie Tat-Komplexe (Tat complex TC1, TC2, TC3) und zwei substratassoziierte Komplexe (TC1S, TC2S) unterschieden werden, wobei TC3 erst durch Mutationen von TatC nachweisbar wurde. In diesem Projekt konnten wir erstmals die beiden Tat-Komplexe TC1 und TC2 biochemisch differenzieren und charakterisieren. Dies wurde möglich, weil wir Mutationen in TatC fanden, die TC1 oder TC2 selektiv stabilisieren oder den jeweils anderen Komplex destabilisieren. Dadurch konnten wir TC1 und TC2 reinigen, ihre Zusammensetzung untersuchen und die Interaktionen biochemisch weiter charakterisieren. Bezüglich ihrer Zusammensetzung haben wir festgestellt, dass TC2 stärker als TC1 mit TatA interagiert, da bei den Reinigungen von TC2 deutlich mehr TatA mitgereinigt wird. Unter den Bedingungen der BN-PAGE-Analyse dissoziiert das meiste mitgereinigte TatA in Form größerer Cluster von TatBC, was die Idee einer lateralen Assoziation von TatA Clustern an TatBC Kernkomplexe unterstützt. Dies wird durch Cross-linking-Analysen weiter untermauert, mit denen wir zeigen konnten, dass bei TC1 und TC2 die gleiche TatC:TatA Interaktionsstelle genutzt wird, was darauf hinweist, dass die TatA-Assoziation nicht mit größeren Umlagerungen in den TatBC Kernkomplexen einhergeht. Die TatA-Interaktionsstellen blieben auch bei Substratbindung unverändert und werden daher wahrscheinlich während des gesamten Transportes genutzt. Auffällig war, dass Substratbindung die TatA-TatC-Interaktion gegenüber der Behandlung mit dem Detergens Digitonin im Zuge der Solubilisierung der Tat-Komplexe empfindlicher machte, was darauf hinweist, dass Substratbindung Konformationsänderungen in TatBC verursacht, die sich auf die TatA-Interaktionsstelle auswirken. Basierend auf diesen Ergebnissen war es möglich, die beiden Tat-Komplexe in den Ablauf von Assemblierung und Transport einzuordnen. Dadurch konnte ein besseres mechanistisches Verständnis des Tat-Transports gefalteter Proteine erreicht werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Towards a functional and structural understanding of membrane-weakening by TatA. Poster on the EMBO Meeting „New challenges in protein translocation across membranes“, 17 – 21 September 2022 in Sant Feliu de Guixols, Spain
Mehner-Breitfeld, D. et al.
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A larger TatBC complex associates with TatA clusters for transport of folded proteins across the bacterial cytoplasmic membrane. Scientific Reports, 14(1).
Werner, Max-Hinrich; Mehner-Breitfeld, Denise & Brüser, Thomas
