Differentielle Proteomik des humanen Apolipoproteins E (APOE) und Untersuchung dessen Interaktion mit Mitochondrien-assoziierten Membranen und Proteinen

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Privatdozentin Dr. Patricia Hübbe; Professor Dr. Andreas Tholey
• Fachliche Zuordnung: Ernährungswissenschaften
• Förderung: Förderung seit 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448478889

Klassischerweise ist Apolipoprotein E (APOE) für seine Rolle im Rezeptor-vermittelten Lipidtransport bekannt, allerdings ebenso für die Krankheitsrisikobeziehung der humanen APOE4-Variante, wobei die krankheitsbezogenen molekularen Mechanismen noch nicht endgültig erforscht. Es gibt Hinweise, dass APOE und seine Isoformen die Expression und Funktion mitochondrialer Proteine beeinflusst. Wir haben in Vorarbeiten einen möglichen Interaktionspartner von APOE durch Co-Immunopräzipitation identifiziert, das mitochondriale Protein BCKDHA (Branched chain keto acid dehydrogenase E1 subunit alpha).Das beantragte Vorhaben besteht aus drei Teilprojekten mit unterschiedlicher Risikoeinstufung (in absteigender Reihenfolge): Der Validierung der APOE-BCKDHA-Interaktion und Abklärung deren biologischer Signifikanz, der funktionellen Charakterisierung der Akkumulation von APOE an Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen (MAM) sowie der Erforschung differentieller Proteomik und proteolytischer Fragmentierung in Abhängigkeit der APOE-Isoform. Die drei Teilprojekte können unabhängig voneinander bearbeitet werden, wodurch der erfolgreiche Abschluss des Gesamtprojektes per se auch bei unerwarteten Ergebnissen vor allem in den „Hochrisiko“-Arbeitspaketen gewährleistet werden kann.Zunächst wird die APOE-BCKDHA-Interaktion in einem unabhängigen in situ-Ansatz validiert und potentielle Mechanismen der mitochondrialen Translokation von APOE erforscht. BCKDHA ist eine Untereinheit des Dehydrogenase-Enzymkomplexes BCKD, dessen Aktivität in Ab- und Anwesenheit von APOE und seinen Isoformen untersucht werden soll. Wie bereits beschrieben, akkumuliert APOE in MAM, aber die Rolle der Isoformen oder dessen Signifikanz sind nicht klar definiert. Deswegen ist geplant, mittels siRNA oder Überexpression verschiedener APOE-Isoformen den Aufbau und biochemische Aktivität von MAM über Gradientenzentrifugation, Immunoblotting und Markerenzymaktivitäten in Ab- und Anwesenheit von APOE zu analysieren. Mittels quantitativer Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-basierter Proteomik wird eruiert, inwieweit die relative Abundanz von Proteinen zentraler Stoffwechselwege durch verschiedene APOE Isoformen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beeinflusst wird. Die intrazelluläre proteolytische Prozessierung von APOE soll mittels LC-MS-basierter N- und C-Terminomics-Methoden charakterisiert werden. Über eine umfangreiche Sammlung gefrorener Gewebe aus vorangegangen Ernährungsstudien ist es möglich, Analysen zur differentiellen Proteomik, proteolytischen Fragmentierung sowie der BCKD Aktivität vor dem Hintergrund verschiedener APOE-Genotypen und Ernährungsfragestellungen in vivo durchzuführen. Die Ergebnisse des beantragten Projektes können zu der Identifizierung bisher unbekannter biologischer Funktionen von APOE führen und Erkenntnisse zum Verständnis molekularer Mechanismen der Krankheitsrisikobeziehung der APOE-Isoformen beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Gerald Rimbach