Molekulare Evolution von Elongationsfaktor P in Escherichia coli

• Antragstellerin: Professorin Dr. Kirsten Jung
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 449926427

Dieses Forschungsprojekt zielt darauf ab, die natürlichen Variationen des Elongationsfaktors P (EF-P) molekular besser zu verstehen und eine evolvierte Variante für die heterologe Expression von Polyprolin-haltigen Proteinen in Escherichia coli zu generieren. Während der Translation von zwei und mehr aufeinanderfolgenden Prolinen kommt es zu einer Ribosomenpause, die durch EF-P aufgehoben werden kann. EF-P ist in normalerweise nur nach post-translationaler Modifikation aktiv. Beispielsweise, wird EF-P in dem vielfältig als Chassis für biotechnologische Anwendungen genutzten Escherichia coli ß-lysinyliert, wofür die Aktivität von zwei Enzymen, der L-Lysin-2,3-Aminomutase EpmB und der (R)-ß-Lysin-Ligase EpmA, notwendig ist. Während in E. coli nur eine moderate Anzahl von Polyprolin-Motiven vorkommt, übersteigt die Zahl dieser Arrestmotive die Gesamtzahl der kodierten Proteine in Actinobacteria. Insbesondere sind diese Motive in Proteinen des Sekundärstoffwechsels, z.B. für die Synthese von Polyketiden in Streptomyces-Spezies, akkumuliert. Wir haben vor kurzem gefunden, dass Streptomyceten und andere Actinobacteria ein EF-P verwenden, das ohne jegliche post-translationale Modifikation funktionsfähig ist, und damit diese Belastung kompensieren. Charakteristisch für diese Art von EF-P ist eine starre Schleife (Pro-Gly-Lys-Gly-Pro), in die die normalerweise modifizierte Aminosäure eingebettet ist. Diese Schleife ist namensgebend für die EF-P PGKGP-Unterfamilie. Synthetische Biologen sind in der Lage, neue Polyketide mit Hilfe von Plug-and-Play-Methoden zusammenzusetzen, jedoch ist die heterologe Expression der beteiligten Proteine in E. coli schwierig. Wir wollen uns diesem Problem widmen, indem wir ein EF-P entwickeln, das ohne post-translationale Modifikation in E. coli voll funktionsfähig ist. Wir wissen bereits, dass die Einführung einer starren Schleife im E. coli EF-P nicht ausreicht, um eine funktionelle unmodifizierte Variante zu erzeugen. Deshalb wollen wir iterative Zyklen der gerichteten Evolution anwenden, die mit der Suche nach einem geeigneten PGKGP-EF-P als Ausgangsbasis beginnen und sich mit dem Screenen von immer aktiveren EF-P Varianten nach ortsgerichteter und zufälliger Mutagenese von efp fortsetzen. EF-P mit der höchsten in vivo und in vitro Aktivität soll ausgewählt und entsprechende E. coli Expressionsstämme sollen hergestellt werden. Diese sollen umfassend charakterisiert sowie auf die Eignung für die Polyketid-Produktion von heterolog produzierten Polyketid-Synthasen aus S. coelicolor getestet werden. Projektbegleitend wollen wir erstmals die post-translationale Modifikation von EF P in Spezies der Bacteriodetes und alpha-Proteobakterien analysieren, die ebenfalls zur PGKGP-Unterfamilie gehören. Mit diesem Projekt wollen wir zum einen den Werkzeugkasten für die Synthetische Biologie erweitern, und zum anderen neue funktionelle und mechanistische Einsichten in den fundamentalen Prozess der Translation erhalten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen