In vivo Gentherapie von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung von Sichelzellanämie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Sichelzellanämie (SCD) ist eine Erbkrankheit der Erythrozyten, von der weltweit Millionen Menschen betroffen sind. Die Polymerisation von Sichelzellhämoglobin führt zu Hämolyse und mikrovaskulären Verschlüssen. Die Folgen sind schmerzhafte Sichelzellkrisen, Schlaganfall, akutes Thoraxsyndrom und chronische Organschäden. Therapeutische Optionen bestehen aus Bluttransfusionen oder Hydroxycarbamid, wodurch fetales Hämoglobin (HbF) induziert wird. Die einzige heilende Behandlungsoption ist eine Knochenmarkstransplantation. Jedoch ist das Risiko einer Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit hoch und geeignete HLA-passende Spender stehen nur für 15 % der SCD-Patienten in den USA zur Verfügung. Eine Gentherapie mit autologen Stammzellen beseitigt diese Einschränkungen und bietet eine potenziell heilende Therapie für alle Patienten. Dennoch verhindern die Kosten und die erforderliche Infrastruktur einen breiteren Einsatz einer Gentherapie, insbesondere in Entwicklungsländern. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer in vivo Gentherapie, um diese Einschränkungen zu überwinden. Dazu werden retrovirale Vektoren mit dem Baboon Endogenous Retrovirus (BaEV) Glykoprotein pseudotypisiert, da dieses Glykoprotein einen effizienten Gentransfer in ruhende Blutstammzellen ermöglicht und serumresistent ist. Zunächst haben wir eine stabile BaEV- Verpackungszelllinie generiert, um pseudotypisierte retrovirale BaEV-Partikel mit hohem Titer und hoher Qualität herzustellen. Kompetitive Transplantationsexperimente in humanisierten Mäusen ergaben, dass sowohl lenti- als auch alpha-retrovirale Partikel eine vergleichbare Effizienz für den Gentransfer in Blutstammzellen besitzen. Um den Gentransfer zu verbessern, haben wir die Mobilisierung von Blutstammzellen durch die kombinierte Gabe von AMD3100 und Gro-beta in humanisierten Mäusen optimiert. Nach intravenöser Injektion viraler Partikel erreichte die anfängliche Genmarkierung 3,5% der menschlichen Zellen. Um die transduzierten Zellen anzureichern, haben wir die Methyltransferase MGMT-P140K überexprimiert, welche eine Resistenz gegen das Chemotherapeutikum BCNU vermittelt. Nach drei Zyklen einer BCNU-Behandlung beobachteten wir eine 20- bis 144-fache Anreicherung genmarkierter Zellen im peripheren Blut, wobei entweder eine niedrige bzw. eine hohe Dosis verabreicht wurde. Im Knochenmark erreichte die Genmarkierung 6-7% der Zellen und 18,1 % in Blutstammzellen. Die Analyse barcodierter viraler Vektoren ergab die Transduktion und Expansion mehrerer Klone in primären und sekundären Transplantationen. Schließlich benutzten wir einen therapeutischen Vektor, der miRNA-eingebettete shRNAs (shmiR) gegen die Transkriptionsfaktoren BCL11A und ZNF410 exprimiert, um Sichelzellanämie zu therapieren. Die Herunterregulierung von BCL11A und ZNF410 in Erythrozyten führt zu einer anhaltenden Reaktivierung von Gammaglobin und HbF, was die hämatologischen Auswirkungen der Sichelzellenanämie weitgehend beseitigt. Wir beobachteten eine signifikante Hochregulierung von Gammaglobin und HbF in den genmarkierten Zellen nach in vivo Gentherapie (35% und 25%). Zusammenfassend zeigen wir die Fähigkeit der BaEV-pseudotypisierten retroviralen Partikel für den in vivo Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen und ihren potenziellen nutzen zur Behandlung von Sichelzellenanämie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Genetic engineering of a virus producer cell line to generate high-titer and high-quality BaEVRlesspseudotyped alpha-retroviral particles. ESGCT Collaborative Virtual Congress 19-22 October 2021. Human Gene Therapy.
Klatt D., Wright K.E., Wolf S., Schambach A., Verhoeyen E., Williams D.A. & Brendel C.
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Stable BaEVRless producer cell line for the production and in vivo application of alpharetroviral particles. ASGCT Annual Meeting. Washington DC 16-19 May 2022. Molecular Therapy.
Klatt D., Mucci A., Zhang C.Y., Wright K.E., Wolf S., Schambach A., Verhoeyen .E, Williams D.A. & Brendel C.
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In vivo HSC gene therapy using BaEVRLess-pseudotyped retroviral vectors. ASGCT Annual Meeting. Los Angeles 16-20 May 2023. Molecular Therapy.
Klatt D., Liu B., Mucci A., Peschers M., Schiroli G., Schambach A., Harris C., Pellin D., Manis J., Armant M., Scadden D.T., Verhoeyen E, Williams D.A. & Brendel C.
