In-situ Kryo-Elektronentomographie aktiv feuernder neuronaler Synapsen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Fusion synaptischer Vesikel mit der Membran der präsynaptischen aktiven Zone stellt das grundlegende Prinzip der Neurotransmitterfreisetzung dar - und damit der neuronalen Kommunikation. Obwohl die ersten Elektronenmikroskopie-Bilder fusionierender Vesikel vor mehr als 50 Jahren aufgenommen wurden, sind wir noch immer weit davon entfernt, alle molekularen, biophysikalischen und kinetischen Aspekte des Fusionsprozesses zu verstehen. In dem hier vorgestellten Projekt habe ich einen Workflow entwickelt, mit dem sich die Fusion von Vesikeln mit höchster struktureller und zeitlicher Auflösung charakterisieren lässt. Konkret habe ich Neurone optogenetisch stimuliert und anschließend mittels Plunge Freezing kryofixiert, was es mir ermöglichte, zelluläre Prozesse nur 2-5 ms nach einem Aktionspotential zu untersuchen. Um zu beurteilen, ob die Stimulation erfolgreich war, und um Synapsen zu identifizieren, die Neurotransmitter freigesetzt haben, habe ich den Glutamatsensor iGluSnFR für die kryokonfokale Mikroskopie verwendet. Glutamat, das während der Vesikelfusion freigesetzt wird, kann an iGluSnFR binden, was zu einer Konformationsänderung des Biosensors und einem damit verbundenen Anstieg der Fluoreszenzintensität führt. Während der kombinierten optogenetischen Stimulation und Kryofixierung wurde iGluSnFR in seinem Glutamatgebundenen Zustand arretiert. Somit konnte ich die Fluoreszenzintensität als Marker für synaptische Aktivität verwenden. Als aktiv identifizierte Neurone habe ich anschließend für die Kryo-Elektronentomographie verwendet. Mit dieser 3D-Mikroskopie-Methode können durch Fixierung oder Färbung herbeigeführte Artefakte vermieden werden, was zu einer optimalen Probenerhaltung und strukturellen Auflösung führt. In meinen optogenetisch stimulierten neuronalen Proben konnte ich verschiedene Stadien der synaptischen Vesikelfusion identifizieren, darunter das Tethering von Vesikeln, die Bildung einer Fusionspore, eine erweiterte Fusionspore und die Integration der Vesikelmembran in die Membran der präsynaptischen aktiven Zone. Mit diesen Ergebnissen konnte ich bestätigen, dass mein Workflow erfolgreich etabliert wurde. Ich gehe davon aus, dass zukünftig die Kombination von Optogenetik und Kryo-Elektronentomographie helfen wird, bisher nicht lösbare Probleme und offene Fragen auf dem Gebiet der synaptischen Übertragung neu zu betrachten. Darüber hinaus werden auch andere Forschungsbereiche, die lichtempfindliche Proteine verwenden, von dem hier entwickelten optogenetischen Plunge Freezer profitieren.
