In-Vitro-Rekonstitution der 3-Prozessierung von mRNA-Vorläufern in Säugern
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Genetische Information wird in Form von DNA gespeichert. DNA-Sequenzen werden selektiv in RNA-Moleküle kopiert, um zur Proteinsynthese zu dienen. Die RNA-Moleküle, die für die Proteinsynthese genetische Information von der DNA im Zellkern zu Ribosomen im Cytoplasma übertragen, heißen messenger RNAs (mRNAs). RNA entsteht zunächst als 1:1-Kopie einer DNA-Sequenz. In Eukaryonten ist dieses sog. primäre Transkript aber nur der Vorläufer für mRNA. Der Vorläufer wird in einer Serie von Prozessierungsschritten in mRNA umgewandelt; erst dann dient die RNA zur Proteinsynthese. Ein Aspekt der Prozessierungsreaktionen ist die 3‘-End-Prozessierung, die Modifikation desjenigen Endes der linearen RNA, das zuletzt synthetisiert wird. Die Vorläufer-RNA geht über die Sequenzen hinaus, die in der reifen mRNA vorhanden sind, ist also zu lang. Im ersten Schritt der 3‘-Prozessierung werden die überschüssigen Sequenzen abgeschnitten: Eine Endonuklease spaltet die RNA in zwei Fragmente. Das 3‘- Fragment wird abgebaut, während das „oberhalb“ der Schnittstelle gelegene 5‘-Fragment die proteinkodierenden Sequenzen enthält und zur mRNA wird. Im zweiten Schritt der 3‘-Prozessierung wird das 5‘-Fragment durch einen Poly(A)-Schwanz verlängert, eine Sequenz aus ca. 250 A-Resten. Der Poly(A)-Schwanz ist für die Funktion der mRNA in der Proteinsynthese und für die Kontrolle ihrer Halbwertszeit wichtig. Wir haben die RNA-Spaltung und Polyadenylierung aus vierzehn Polypeptiden rekonstituiert, die in Insektenzellen oder Bakterien überproduziert und gereinigt wurden: Ein Proteinkomplex namens mammalian polyadenylation specificity factor (mPSF) enthält vier Untereinheiten, von denen zwei das zentrale Polyadenylierungssignal in der RNA, AAUAAA, erkennen. Die Poly(A)-Polymerase ist das Enzym, das den Poly(A)-Schwanz synthetisiert; ATP dient dabei als Vorläufer. Das monomere Polypeptid assoziiert mit mPSF und bevorzugt daher RNAs als Substrate, die eine AAUAAA-Sequenz enthalten. Mammalian cleavage factor (mCF) bildet einen Komplex mit mPSF und besteht aus drei Untereinheiten, von denen CPSF73 die Endonuklease ist, die die Vorläufer-RNA schneidet. Zwei weitere Proteine helfen bei der Selektion der Prozessierungsstelle in der Vorläufer-RNA: cleavage stimulation factor (CstF; drei verschiedene Untereinheiten) und cleavage factor II (CFII; zwei Untereinheiten). Wir haben gefunden, dass ein weiteres monomeres Polypeptid, RBBP6, die Endonuklease CPSF73 dicht an deren aktivem Zentrum bindet und wahrscheinlich aktiviert. Cleavage factor I (CFI) stimuliert die RNA-Spaltung, ist aber nicht essentiell. Dies ist konsistent mit der Rolle von CFI in der alternativen Polyadenylierung, der Selektion von bestimmten Prozessierungsstellen aus mehreren oder vielen, die in der Vorläufer-RNA vorhanden sind. ATP ist durch Bindung an eine CFII-Untereinheit für die Spaltung der RNA notwendig. Unsere Ergebnisse werden weitere mechanistische und strukturelle Untersuchungen der 3‘-Prozessierungsreaktion erleichtern.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Reconstitution of 3′ end processing of mammalian pre-mRNA reveals a central role of RBBP6. Genes & Development, 36(3-4), 195-209.
Schmidt, Moritz; Kluge, Florian; Sandmeir, Felix; Kühn, Uwe; Schäfer, Peter; Tüting, Christian; Ihling, Christian; Conti, Elena & Wahle, Elmar
