Manipulation der Monobactam-Biosynthese zur Erzeugung neuartiger β-Lactam-Antibiotika
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der weit verbreitete Einsatz von β-Laktam-Antibiotika setzte bakterielle Zielorganismen einem immensen Selektionsdruck aus immer stärkere Resistenzmechanismen zu entwickeln, einschließlich der Produktion von β-Laktamasen, die eine zunehmende Zahl verschriebener β-Laktam-Antibiotika unwirksam machen, sodass dringend neue Verbindungen zur Behandlung dieser Krankheitserreger benötigt werden. Sulfazecin, produziert von Pseudomonas acidophila, gehört zur Unterklasse der Monobactame, die aufgrund ihrer charakteristischen N-Sulfonierung resistent gegenüber Metallo-β-Laktamasen sind. Durch die Bereitstellung geeigneter Vorläufermoleküle bestand das Hauptziel dieses Projekts darin, den Sulfazecin-Biosyntheseweg zu nutzen, um durch Mutasynthese funktionalisierte Derivate zu erzeugen, die möglicherweise ein verändertes Bioaktivitätsspektrum aufweisen. Daher wurde eine divergente Synthese entwickelt, um Analoga der nicht-kanonischen Aminosäure L-2,3- Diaminopropionat (L-Dap) als alternative biochemische Bausteine herzustellen. In vitro Assays zeigten, dass die für die Inkorporation in den Biosyntheseweg zuständige Adenylierungsdomäne (A3) zusätzlich zu einer hohen Diastereoselektivität Analoga von L-Dap effizient aktiviert, die einen zusätzlichen Methyl (MeDap)- oder Fluormethyl Substituenten besitzen. Wenn diese einem Knockout-Stamm von P. acidophila zugeführt wurden, der den nativen Vorläufer L-Dap nicht mehr selbst herstellen kann, wurde durch hochauflösende Massenspektrometrie bewiesen, dass jene Analoga tatsächlich den gesamten Biosyntheseweg durchliefen um die entsprechenden Sulfazecin-Derivate durch Fermentation zu produzieren. Bioassays zeigten eine veränderte antibakterielle Aktivität im Vergleich zum nativen Sulfazecin und unterstreichen die intrinsische Fähigkeit dieser Plattform, funktionalisierte Monobactame in nachweisbaren Mengen herzustellen. Erste Versuche, A3 gentechnisch so zu verändern, dass alternative Vorläufer effizienter aktiviert werden, führten zu einer Steigerung der relativen Aktivität gegenüber MeDap um 65 % durch eine einzige Mutation, was das Potenzial dieses Biosynthesesystems weiter hervorhebt. Beim Screening der A3-Mutanten wurde festgestellt, dass etablierte Adenylierungsassays entweder eine geringe Sensitivität aufweisen oder zusätzliche Coenzyme sowie teure Chemikalien und Geräte benötigen. Um eine sensitive und zugleich kosteneffiziente Alternative bereitzustellen, wurde ein neuartiger kolorimetrischer Adenylierungsassay entwickelt, der enzymatisch freigesetztes Pyrophosphat durch einen Farbumschlag von blau nach orange im mikromolaren Bereich visualisiert. Schließlich wurde gezeigt, dass die terminalen Biosyntheseenzyme, die Sulfazecin durch Hydroxylierung bzw. O-Methylierung komplettieren, nachweisliche Aktivität gegenüber synthetischen Monobactamen besitzen, die nicht-native Seitenketten aufweisen. Diese Studien unterstreichen das Potenzial eines chemoenzymatischen Ansatzes zur Entwicklung neuartiger Monobactam-Antibiotika um zur Überwindung bakterieller Resistenzenzyme beizutragen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Colorimetric Determination of Adenylation Domain Activity in Nonribosomal Peptide Synthetases by Using Chrome Azurol S. ChemBioChem, 24(5).
Kahlert, Lukas; Lichstrahl, Michael S. & Townsend, Craig A.
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Synthesis of functionalized 2,3-diaminopropionates and their potential for directed monobactam biosynthesis. Chemical Science, 14(14), 3923-3931.
Lichstrahl, Michael S.; Kahlert, Lukas; Li, Rongfeng; Zandi, Trevor A.; Yang, Jerry & Townsend, Craig. A.
