Entdeckung und gezielte Modifikation von neuartigen kälte-aktiven Cellobiose 2-Epimerasen mit sowohl einer Epimerase- als auch Isomerase-Aktivität

• Antragsteller: Professor Dr. Lutz Fischer
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 492716110

Das Ziel unseres Projektes ist die Entdeckung und molekulare Modifikation von neuartigen kälte-adaptierten Cellobiose 2-Epimerasen (EC 5.1.3.11, CE), welche eine effizientere Umwandlung von Lactose in die Präbiotika Epilactose und Lactulose bei niedrigen Temperaturen katalysieren. Wir wollen die Korrelation zwischen der Thermostabilität und Aktivität verstehen, welche der Kälteanpassung dieser Enzyme zugrunde liegt. Um diese Ziele zu erreichen, werden Metagenombibliotheken von kälte-assoziierten Umweltproben hergestellt. Durch die Verwendung von verschiedenen Metagenom-Screeningansätzen können dann neuartige, kälte-aktive CEs entdeckt werden. Die Sequenz-basierte (in silico) Auswahl von putativen Cellobiose 2-Epimerasen aus der Datenbank über das „Basic Local Alignment Search Tool“ (BLAST) basiert auf deren phylogenetischen Hierarchie und dem Vergleich zu bereits beschriebenen CEs. Für das Funktions-basierte Screening muss zunächst eine sensitive Hochdurchsatz-Screeningmethode auf Agar-Platten etabliert werden. Die identifizierten CE Kandidaten aus der Metagenombibliothek, sowie aus dem in silico Screening, werden rekombinant produziert und hinsichtlich ihrer Aktivität bei niedrigen Temperaturen untersucht. Darüber hinaus ist das „Protein-Engineering“ durch molekulare Modifikationen unter Verwendung gerichteter Evolutionsmethoden, sowie semi-rationales und rationales Design ein vielversprechendes Werkzeug zur Erzeugung von CEs mit besseren kinetischen Eigenschaften. Die Identifizierung von Aminosäuren, die die Zugänglichkeit des katalytischen Zentrums erhöhen oder die Stabilität des aktiven Zentrums verringern, wird hoffentlich die kinetischen Eigenschaften der Wildtyp-CEs bei niedriger Temperatur (8 °C) verbessern. Die neuartigen CEs, die die Biokonversion von Laktose in Epilaktose und Laktulose bei niedrigen Temperaturen katalysieren, stellen einen Vorteil für deren Nutzung in der Milchindustrie dar um z.B. ein prebiotisches Produkt aus einem Bei-Produkt wie Molke zu produzieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen