Funktionelle Untersuchung des mitotischen Mikrotubuli-Zytoskeletts mit Hilfe niedermolekularer chemischer Inhibitoren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Mittelpunkt unserer Forschung stand die funktionelle Untersuchung mitotischer und meiotischer Proteine. Bezüglich der Funktion des mitotischen Kinesins Kif18A bei der Chromosomenkongression konnten wir zeigen, dass dieses Kinesin eine Sonderstellung einnimmt, da es sowohl über Motilität als auch Depolymerisations-Aktivität verfügt. Weitergehende Studien bezüglich der Regulation haben ergeben, dass Kif18A von mehreren mitotischen Kinasen (Cdk1, Plk1 und Aurora-Kinase) phosphoryliert wird. Die komplexe Modifikation von Kif18A erschwerte unsere bisherigen Untersuchungen, welchen Einfluss die Phosphorylierungen auf die enzymatischen Eigenschaften von Kif18A haben. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdk1 die Affinität von Kif18A für Mikrotubuli erhöht. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass Cdk1 bei Eintritt in die Mitose Kif18A aktiviert. Es bleibt jedoch weiterhin die Frage offen, wie die Aktivität von Kif18A an einzelnen Chromosomen, bzw. differentiell an den beiden Schwesterkinetochoren, reguliert ist. Diese lokale Regulation der Aktivität erscheint notwendig, damit sich Chromosomen an der Metaphasenplatte anordnen können. Erfreulicherweise ist es uns gelungen, einen niedermolekularen Kif18A Inhibitor zu identifizieren. Biochemische Analysen zeigten, dass dieser Inhibitor – genannt BTB-1 – reversibel, ATP-kompetitiv und Mikrotubuliunkompetitiv wirkt. Überraschenderweise unterscheidet sich der BTB-1 induzierte zelluläre Phänotyp von dem Kif18A RNAi-Phänotyp. Ziel zukünftiger Arbeiten ist es daher, das zelluläre Zielprotein von BTB-1 eindeutig nachzuweisen. Für die funktionelle Untersuchung der Kinesine Mklp1, Mklp2, MPP1 und Kif4 während der Zytokinese sollten die von uns identifizierten Substanzen SH1 und SH2 zum Einsatz kommen. In vitro inhibieren SH1/SH2 spezifisch die ATPase Aktivität von MPP1. Im Gegensatz zu den publizierten Daten, ist es uns jedoch nicht gelungen, einen Zytokinesedefekt durch die Depletion von MPP1 zu induzieren. Immunoblot-Experimente ergaben, dass in allen untersuchten Zelllinien die verwendeten siRNA-Oligonukleotide MPP1 mindestens genauso effizient depletierten wie die publizierten Oligonukleotide. Bei dem beschriebenen Zytokinesedefekt handelt es sich um ein Apoptose-induziertes Absterben von Zellen, die sich in der Zytokinese befinden. Da wir die Erfahrung gemacht haben, dass Apoptose ein häufiger unspezifischer Effekt von siRNA-behandelten Zellen bei der Echzeitmikroskopie ist, gehen wir davon aus, dass MPP1 keine Rolle in der Zytokinese spielt. Die weiteren Untersuchungen werden sich auf die Identifzierung des zellulären Zielproteins von SH1 und SH2 konzentrieren. Unsere Untersuchungen bezüglich der Regulation der Meiose identifzierten XErp1 als den „cytostatic factor“, der für den Metaphase II Arrest reifer Xenopus Oozyten verantwortlich ist. Durch die direkte Inhibierung der Ubiquitin-Ligase APC/C (anaphase promoting factor/cyclosome) verhindert XErp1 den Abbau von Cyclin-B und Securin und somit den Eintritt in die Anaphase. Bei der Befruchtung leiten Plx1 und CaMKII den Abbau von XErp1 ein. Für den Metaphase II Arrest ist die „zinc binding region“ jedoch nicht die F-box von XErp1 notwendig. Untersuchungen hinsichtlich der Funktion von XErp1 als F-box Protein haben bislang keine neuen Erkenntnisse erbracht. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass XErp1 über seine F-box mit Skp1 interagiert. Es liegt daher die Vermutung nahe, dass XErp1 als Bestandteil der Skp1-Cul1-Fbox (SCF) Ubiquitin-Ligase eine weitere Funktion ausübt. Zukünftige Untersuchungen werden klären, ob diese Funktion für meiotische und/oder mitotische Zellteilungen relevant ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2005) Calcium triggers exit from meiosis II by targeting the APC/C inhibitor XErp1 for degradation. Nature, 437, 1048-52
Rauh NR, Schmidt A, Bormann J, Nigg EA and Mayer TU
- (2005) Synthesis and biological evaluation of new tetrahydro-beta-carbolines as inhibitors of the mitotic kinesin Eg5. Bioorg Med Chem, 13, 6094-111
Sunder-Plassmann N, Sarli V, Gartner M, Utz M, Seiler J, Huemmer S, Mayer TU, Surrey T and Giannis A
- (2005) Xenopus polo-like kinase Plx1 regulates XErp1, a novel inhibitor of APC/C activity. Genes Dev, 19, 502-13
Schmidt A, Duncan PI, Rauh NR, Sauer G, Fry AM, Nigg EA and Mayer TU
- (2006) Stattic: a small-molecule inhibitor of STAT3 activation and dimerization. Chem Biol, 13, 1235-42
Schust J, Sperl B, Hollis A, Mayer TU and Berg T
- (2007) Natural productderived modulators of cell cycle progression and viral entry by enantioselective oxa Diels- Alder reactions on the solid phase. Chem Biol, 14, 443-51
Lessmann T, Leuenberger MG, Menninger S, Lopez-Canet M, Muller O, Hummer S, Bormann J, Korn K, Fava E, Zerial M, Mayer TU and Waldmann H
- (2007) The human kinesin Kif18A is a motile microtubule depolymerase essential for chromosome congression. Curr Biol, 17, 488-98
Mayr MI, Hummer S, Bormann J, Gruner T, Adio S, Woehlke G and Mayer TU
- (2009) Cdk1 negatively regulates midzone localization of the mitotic kinesin Mklp2 and the chromosomal passenger complex. Curr Biol, 19, 607-612
Hummer S and Mayer TU
- (2009). BTB-1: The first small molecule inhibitor of the mitotic motor protein Kif18A, Angew. Chem. Int. Ed., 48, 9072-9076
Catarinella M, Grüner, T, Strittmatter, T, Marx, A, and Mayer, TU
