Charakterisierung von Phosphorylierung und DNA-Bindung pflanzlicher Cryptochrome
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Einfluss der WD-40 Proteine COP1 und von SPA1-4 in Arabidopsis auf den Abbau und die Phosphorylierung von cry2 wurden untersucht. Für diese noch nicht abgeschlossenen Arbeiten stehen alle erforderlichen Mutanten durch Prof. Ute Hoecker (Universität Köln) zur Verfügung. Die bislang vorliegenden Befunde zeigen klar, dass C0P1 und SPA bei der Regulation des cry2 Abbaus und dessen Phosphorylierung beteiligt sind. Diese Arbeiten werden fortgeführt auch mit dem Ziel, die Phosphorylierungsstellen von cry2 zu identifizieren. Hinsichtlich der Aufklärung der biologischen Funktion von cry3, einem Mitglied der cryDASH Familie, stehen zwischenzeitlich zahlreiche RNAi- und Überexpressionslinien zur Verfügung, ebenso eine knock-out Transposon-Linie. In einem weiteren durch die DFG geförderten Projekt, welches im Rahmen der Forschergruppe 526 bearbeitet wird, konnten wir zeigen, dass cry3 an Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPD) in loop-Strukturen doppelsträngiger DNA bindet und diese UV-Läsionen repariert. Somit konnte ein wichtiger Teilaspekt zu diesem Projekt (DNA-Bindung) erfolgreich abgeschlossen werden. Der in Photolyasen und Cryptochromen (einschließlich der cryDASH Familie) vorhandene Methenyl-Tetrahydrofolat Kofaktor galt bislang ausschließlich als Antennenchromophor, der Lichtanregung über einen Förster-Energietranfer auf das (katalytische) FAD überträgt. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass in der E. coli Photolyase und in Arabidopsis cry3 dieser Kofaktor lichtinduziert zu Methylen-Tetrahydrofolat reduziert wird. Hierfür ist die in diesen Proteinen konservierte Tryptophan-Triade und reduziertes FAD notwendig. Somit konnten wir neben den beiden bekannten Elektronentransferwegen einen dritten Elektronentransferweg für Mitglieder der Photolyase-Familie identifizieren. Zukünftige Untersuchungen an Arabidopsis cry3 Mutanten und Überexpressionslinien werden zeigen, inwieweit cry3 eine (lichtabhängige) Rolle im Folatstoffwechsel spielt. Eine duale Funktion als Photolyase und Photorezeptor wurde für pilzliche Photolyasen z.B. durch die AG Prof. Braus beschrieben. Wir haben die Klasse II CPD- Photolyase von Arabidopsis in Arabidopsis überexprimiert. Pflanzen dieser Überexpressionslinien zeigen in Abwesenheit von UV-B keinen zum Wildtyp veränderten Phänotyp, sodass ausgeschlossen werden kann, dass die Klasse II CPD-Photolyase von Arabidopsis als Photorezeptor fungiert. Allerdings werden in diesen Pflanzen CPDs sehr viel rascher als im Wildtyp repariert und die erzielte Biomasse ist unter UV-B höher als im Wildtyp. Ebenso konnten wir nachweisen, dass die Arabidopsis CPD-Photlyase ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2009) Photoreduction of the folate cofactor in members of the photolyase family. J. Biol. Chem.
Moldt J., Pokorny R., Orth C, Linne U., Geisselbrecht Y., Marahiel M.A., Essen L.- O., Batschauer A.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1074/jbc.M109.018697) - (2009). Increased DNA-repair in Arabidopsis plants overexpressing CPD photolyase. Planta, 230, 505-515
Kaiser G., Kleiner O., Beisswenger C., Batschauer A.
