Vaskuläre Funktionen Cytochrom P450-abgeleiteter Eicosanoide in der pulmonalen Strombahn
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel dieses Forschungsprojektes war, Entstehungs- und Wirkungsprofil do von dem gemeinsamen Substrat Arachidonsäure (AA) über das Cytochrom P450 (CYP) abgeleiteten Epoxycicosatriensäuren (EET) und deren Epoxidhydrolasederivate, die Dihydroxyeicosatriensäure (DHET) im Hinblick auf ihre mögliche Rolle als Endothelium- Derived Hyperpolarizing Factor (EDHF) in der (humanen) pulmonalen Zirkulation zu untersuchen. Gleichzeitig sollten die beiden anderen Hauptwege do AA-Kaskade - Lipoxygenase(LOX)- und Cyclooxygenase( COX)-Metabolismus - erfaßt werden, um die Entstehungs- und Wirkungsprofile der Zielsubstanzen (EET/DHET) mit denen aller anderen vasoaktiven Eicosanoide (LOX- und COX-Produkte) vergleichen und somit ihren effektiven Beitrag zu pulmonalen Vasoregulation im Gesamtkontext aller Mediatoren bestimmen zu können. Durch diese methodologisch gesamtheitliche Herangehensweise können, im Unterschied zu den bisherigen, die Existenz der übrigen Lipidmediatoren ignorierenden und somit die Physiologie/Biochemie der EET/DHET isoliert betrachtenden Untersuchungen, konsistente Ergebnisse erzielt und Fehlschlüsse weitestgehend vermieden werden. Zwei weitere methodologische Aspekte, welche für die zahlreichen in der Fachliteratur feststellbaren Widersprüchlichkeiten betreffend die physiologischen Wirkungen der EET/DHET offensichtlich verantwortlich sind, bestehen darin, daß a.) bis jetzt eine für die eindeutige Korrelation zwischen Entstehungs- und Wirkungsprofil notwendige empfindliche substanzspezifische, d.h., stereospezifische/chirale Bestimmung der EET nicht möglich und b.) insgesamt die quantitative Empfindlichkeit der verfügbaren analytischen Methoden zu niedrig war. Um für die gegenwärtig durchzuführenden Untersuchungen sowie die nachfolgende Forschung die besten analytischen Voraussetzungen zur Erzielung widerspruchsfreier Ergebnisse durch Gewährleistung der genannten drei methodologischen Merkmale - gesamtheitliche, 2.) chirale/stereospezifische und 3.) hochempfindliche Analytik - zu sichern, wurden zwei kapillare flüssigchromatographische Methoden entwickelt: Eine gesamtheitliche Analytik zur Bestimmung aller relevanten Eicosanoide (44 Mediatoren) der AA-Kaskade sowie eine chirale Technik zur gleichzeitigen Bestimmung aller acht EET Enantiomere. Beide Methoden ermöglichen Routinemessungen mit hohem Probendurchsatz, höchste quantitative Empfindlichkeit bis in den Femtogrammbereich durch den Einsatz von Kapillarsäulen sowie maximale Zuordnungssicherheit mittels massenspektrometrischer Detektion. Mit diesen analytischen Verfahren wurden Messungen an den Modellen der isoliert perfundierten und ventilierten humanen Lunge und Kaninchenlunge durchgeführt. Der direkte Vergleich aller Mediatorenprofile in der hypoxisch ventilierten Kaninchenlunge mit Hilfe der gesamtheitlichen Eicosanoidanalytik ergab, daß abgesehen von Prostaglandin 2α und 5-HETE, die CYP-abgeleiteten EET/DHET die einzigen Autacoide waren, die als Mediatoren der gemessenen hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) in Frage kamen. Darüberhinaus, zeigte die chirale Analyse auch eine stereospezifische Beteiligung der EET, nämlich die des 14(S),15(R)-Enantiomers, an der vierstündigen HPV. Weiterführende Untersuchungen unter Bedingungen langzeitiger (16-24 h) oder chronischer (bis zu 1 Woche) Hypoxie würden sicherlich, infolge der Induktion spezifischer CYP-Isoformen, die stereospezifische Beteiligung auch der anderen Regioisomere (11,12-, 8,9-, 5,6-EET) an do pulmonalen Hypertonie (PH) und der damit verbundenen Gefäßneubildung (vascular remodeling) dokumentieren. Auch Untersuchungen am Modell der isoliert perfundierten und normoxisch ventilierten humanen Lunge (O.P. Material) zeigten, in Übereinstimmung mit früheren Befunden des Antragstellers, eine unter inflammatorisch-pathophysiologischen Bedingungen (Stimulation mit dem bakteriellen Tripeptid FMLP oder dem Exotoxin ECH) erhöhte Freisetzung der EET/DHET im Gesamtkontext der übrigen vasoaktiven Mediatoren der AA-Kaskade bei gleichzeitigem Anstieg des pulmonalarteriellen Druckes. All diese Befunde festigten, in Übereinstimmung mit zeitgleich erfolgten Untersuchungen am Mausmodell der chronischen, hypoxieneinduzierten PH unter Beteiligung des Antragstellers, die These, daß die AA/CYP-abgeleiteten EET/DHET in der Lunge, im Unterschied zum koronararteriellen Bereich, eine vasokonstriktive Wirkung ausüben. Erste Versuche mit Applikation exogener EET am Modell der isoliert perfundierten und ventilierten Kaninchenlunge bestätigten die vasokonstriktive Funktion der Oxirane im pulmonalvaskulären Bereich. Eine vasodilatative Wirkung der EET/DHET und damit die, in Analogie zum kardiovaskulären Bereich auch in der Lunge postulierte Rolle als potentielle EDHF konnte nicht festgestellt werden. Zusammenfassend, kann aus den Befunden abgeleitet werden, daß weiterführende Untersuchungen erforderlich sind, um die Rolle der EET/DHET generell als pulmonale Vasokonstriktoren unter inflammatorisch-pathophysiologischen Bedingungen und speziell als Mediatoren m der HPV sowie m der Pathogenese der PH des Menschen aufzuklären und auf dieser Basis neue Strategien in Diagnose und Therapie dieser schwerwiegenden Krankheit (Patienten mit PH weisen eine mittlere Überlebenszeit von nur ca. sechs Jahren auf) zu entwickeln.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Direct and simultaneous profiling of qxixyeicosatrienoic acid enantiomers by capillary tandem column chiral-phase liquid chromatography with dual online photodiode array and tandem mass spectrometric detection. (2008) Anal Bioanal Chem, [Epub ahead of print]
Kiss L, Bier J, Röder Y, Weissmann N, Grimminger F, Seeger W
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00216-008-2308-1) - Direct eicosanoid profiling of the hypoxic lung by comprehensive analysis via capillary liquid chromatography with dual online photodiode-array and tandem mass-spectrometric detection. (2008) Anal Bioanal Chem 390(2):697-714
Kiss L, Röder Y, Bier J, Weissmann N, Seeger W, Grimminger F
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1007/s00216-007-1718-9)
