Entwicklung von Methoden zur Totalsynthese von einheitlichen Glycoproteinen

• Antragsteller: Professor Dr. Carlo Unverzagt
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2003 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 5398417

• Erstellungsjahr: 2012

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Glycoproteine gehören zu den wichtigsten Proteinkonjugaten, da sie an der Zelloberfläche und außerhalb der Zelle eine Vielzahl von Funktionen ausüben. In vielen Fällen ist die biologische Aktivität vom Kohlenhydrat abhängig. Auf Grund der Heterogenität des Kohlenhydratanteils natürlicher Glycoproteine sind reine Glycoformen aus natürlichen Quellen bisher nicht verfügbar. Wir haben daher einen chemischen Zugang durch Semisynthese gesucht. Dies gelang durch native chemische Ligation verschiedener Glycoproteinfragmente, die durch Kombinationen aus chemischer Oligosaccharidsynthese, Festphasenglycopeptidsynthese, enzymatischen Methoden und Molekularbiologie erhalten werden konnten. Mit Hilfe der nach dieser Vorgehensweise erhältlichen, einheitlichen Glycoproteine können erstmals die Voraussetzungen für detaillierte Struktur-Wirkungsuntersuchungen von Glycoproteinen geschaffen werden. Als Modell-Glycoproteine konnten bovine Ribonuklease C und humanes Interleukin 6 erstmals synthetisiert und charakterisiert werden. Die beiden back-to-back Publikationen über RNAse C wurden in der Angewandten Chemie auch als Highlight referiert und in C&E news unter Science Concentrates vorgestellt. Die Zugänglichkeit ausreichender Mengen eines einfachen biantennären N-Glycans als Baustein für Glycoproteinfragmente konnte durch den enzymatischen Verdau eines kurzen Glycopeptids aus Eigelb realisiert werden. Die Verfügbarkeit der biologisch relevanten multiantennären N-Glycane in Form von Aziden konnte durch Weiterentwicklung der modularen Synthesemethode erreicht werden. Kritisch für den Verlauf des Projekts waren anfänglich die molekularbiologisch gewonnenen Fragmente, deren Verfügbarkeit mittlerweile nach einer Optimierung der Reinigungsverfahren und der Vermeidung von Nebenreaktionen als sehr effizient anzusehen ist. Weitaus schwieriger und mit vielen sequenzabhängigen Unvorhersehbarkeiten behaftet ist die Synthese von langen Glycopeptiden mit komplexen Glycanen und deren Thioester. Dank zahlreicher Verbesserungen bei der Synthese von Thioestern und konvergenten Methoden bei der Verlängerung der Peptide an der Festphase konnten bisher nicht zugängliche Sequenzen erhalten werden. Weiterhin konnten neue Ligationsmethoden unter Verwendung latenter Thioester für Glycopeptide eingesetzt werden, was im Falle von IL-6 eine vorteilhafte Ligationsumkehr vom N- zum C-Terminus erlaubte. Dieses führte zu einer stark verbesserten Reinheit der Ligationsprodukte und der Zielproteine. Insgesamt konnte das Ziel erreicht werden, thiolreiche Glycoproteine mit einem N-Glycan und günstiger Verteilung der Cysteinreste durch Semisynthese darzustellen. Dies legt die Basis, um Bibliotheken von N-Glycoproteinen aufzubauen und daran den Einfluß der Kohlenhydrate zu studieren. Zukünftig sollten auch anspruchsvollere Glycoproteine mit größerer Kettenlänge, mehreren Oligosacchariden und wenigen Cysteinresten synthetisch zugänglich werden.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• „An Orthogonal Double-Linker Resin Facilitates the Efficient Solid-Phase Synthesis of Complex-Type N-Glycopeptide Thioesters Suitable for Native Chemical Ligation“. Angew. Chem. 2005, 117, 1677-1681
  S. Mezzato, M. Schaffrath, C. Unverzagt
  
• „The asialoglycoprotein receptor clears glycoconjugates terminating with sialic acidalpha2,6GalNAc“. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2005, 102, 17125-9
  E. I. Park, Y. Mi, C. Unverzagt, H.J. Gabius, J.U. Baenziger
  
• „Substitutions in the N-Glycan Core as Regulators of Biorecognition: The Case of Core-Fucose and Bisecting GlcNAc Moieties“. Biochemistry 2007, 46, 6984-6995
  S. Andre, T. Kozar, R. Schuberth, C. Unverzagt , S. Kojima, HJ. Gabius
  
• „Synthese von pentaantennären N-Glycanen mit Bisecting-GlcNAc und Core-Fucose“. Angew. Chem. 2007, 119, 4251-4253
  S. Eller, R. Schuberth, G. Gundel, J. Seifert und C. Unverzagt
  
• „A Double Regio and Steroselective Glycosylation Strategy for the Synthesis of N-Glycans“. Chem. Eur. J., 2008, 14, 1304- 1311
  C. Unverzagt, S. Eller, S. Mezzato, R. Schuberth
  
• „High Affinity Interaction between a Bivalve C-type Lectin and a Biantennary Complex-type N-Glycan Revealed by Crystallography and Microcalorimetry“. J. Biol. Chem. 2008, 283, 30112–30120
  J.-P. Gourdine, G. Cioci, L. Miguet, C. Unverzagt, D. Varon Silva, A. Varrot, C. Gautier, E. J. Smith-Ravin, and A. Imberty
  
• „Semisynthesis of a Homogeneous Glycoprotein Enzyme: Ribonuclease C Part 1“. Angew. Chem. 2009, 121, 1968-1973
  C. Piontek, P. Ring, O. Harjes, C. Heinlein, S. Mezzato, N. Lombana, C. Pöhner, Markus Püttner, D. Varón Silva, A. Martin, F. X. Schmid and C. Unverzagt
  
• „Semisynthesis of a Homogeneous Glycoprotein Enzyme: Ribonuclease C Part 2“. Angew. Chem. 2009, 121, 1974-1978
  C. Piontek, D. Varón Silva, C. Heinlein, C. Pöhner, S. Mezzato, P. Ring, A. Martin, F. X. Schmid and C. Unverzagt
  
• „Synthesis of Multiantennary Complex Type N-Glycans by Use of Modular Building Blocks“. Chem. Eur. J., 2009, 15, 12292-12302
  C. Unverzagt, G. Gundel, S. Eller, R. Schuberth, J. Seifert, H. Weiss, M. Niemietz, M. Pischl, C. Raps
  
• „Insights into the Dynamics and Molecular Recognition Features of Glycopeptides by Protein Receptors. The three-dimensional Solution Structure of Hevein bound to the Trisaccharide core of N-Glycoproteins“. Chem. Eur. J., 2010, 16, 10715-10726
  J. J. Hernández-Gay, A. Ardá, S. Eller, S. Mezzato, B. R. Leeflang, C. Unverzagt, F. J. Cañada, J. Jiménez-Barbero
  
• „Structural basis of flocculin-mediated social behavior in yeast“. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2010, 107, 22511-22516
  M. Veelders, Stefan Brückner, Dimitri Ott, Carlo Unverzagt, H.-U. Mösch, and L.-O. Essen
  
• „Synthesis of an Fmoc-Asn-heptasaccharide building block and its application to chemoenzymatic glycopeptide synthesis“. Carbohydr. Res. 2010, 345, 1306-1315
  S. Mezzato, C. Unverzagt
  
• „Fragment condensation of C-terminal pseudoproline peptides without racemization on the solid phase“. Angew. Chem. 2011, 123, 6530 –6534; Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6406–6410
  C. Heinlein, D. Varón Silva, A. Tröster, J. Schmidt, A. Gross C. Unverzagt
  
• „Selective Oxidative Debenzylation of Mono- and Oligosaccharides in the Presence of Azides“. Chem. Commun. 2011, 47, 10485 – 10487
  M. Niemietz, L. Perkams, J. Hoffman, S. Eller, C. Unverzagt