Untersuchungen zur Beteiligung von Polymerase (NIb) und Helikase (CI) des Plum pox virus der Pflaume (PPV) an der RNA-Rekombination
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die virale RNA Rekombination ist einer der wichtigen Faktoren für genetische Variabilität und Evolution. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind vielschichtig, variabel und bisher nur unvollständig verstanden. Im hier bearbeiteten Projekt wurde für das pflanzenpathogene RNA Virus potato virus X (PVX), Familie Flexiviridae, Genus Potexvirus ein experimentelles System zur in vivo Charakterisierung der RNA Rekombination unter hohem Selektionsdruck entwickelt. Dies System basiert auf der Agrobakterium vermittelten Expression von in vivo Transkripten des Virus, welches mit einem Ausbreitungsdefekt über eine Deletion im Hüllproteingen versehen ist und der Co-Expression des komplementären intakten viralen Gens. Da das virale Genom mit einem Fluoreszenzmarker ausgestattet war, konnte das Auftreten von in der Ausbreitungsfunktion rekonstituierten Rekombinanten, wie auch die Häufigkeit, über das Fluoreszenzsignal in vivo nachgewiesen werden. Mit dem Rekombinationssystem konnte für ein weiteres RNA Pflanzenvirus, für das bisher keine Informationen zum Mechanismus der Rekombination wie auch zu den die Rekombination beeinflussenden Faktoren vorlagen, ein Modellsystem für homologe virale Rekombination etabliert werden. Mit der Herstellung einer Vielzahl von Hüllprotein-Deletionsmutanten unterschiedlicher Länge, wurde ein eindeutiger positiver Zusammenhang zwischen der Länge der homologen Sequenzüberlappung und der Häufigkeit des Auftretens von Rekombination gezeigt und der zugrunde liegende Mechanismus der Klasse der homologen „similarity assisted“ Rekombination zugeordnet. Die Herstellung von weiteren agroinfizierbaren Deletionsmutanten des Virus erlaubte damit, über die Kopplung der RNA Rekombination an die Rekonstituierung der Markerfluoreszenz, den Nachweis des exakten Zeitpunktes und der Häufigkeit der auftretenden RNA-Rekombination. Die Nutzung von intakten PVX Hüllproteingenen mit abweichender Sequenz ermöglichte erstmals die Eingrenzung von Sequenzbereichen, in denen der vermutete Templatewechsel der viralen RNA abhängigen RNA Polymerase auftritt, wie auch den Nachweis der Zusammensetzung der rekombinanten Sequenz. Über eine Vorhersage der RNA-Sekundärstruktur der an der Rekombination beteiligten Sequenzen konnte nachgewiesen werden, dass die PVX Rekombination bevorzugt in Bereichen mit einer „stem-loop“ Struktur stattfindet. Das fluoreszenzmarkierte PVX konnte nach Herstellung einer Insertionsmutationsbibliothek der RdRp genutzt werden, um eine funktionelle Karte der Regionen des Proteins herzustellen, die essentiell für die virale Replikation sind. Unter Einsatz dieser RdRp Bibliothek war es weiterhin erstmals möglich, Bereiche der PVX RdRp zu identifizieren, die an der viralen Rekombination beteiligt sind. Damit ist PVX nach dieser Studie ein weiteres Modellvirus für die Charakterisierung viraler Rekombination. Das hier etablierte System zur in vivo Charakterisierung der PVX RNA Rekombination besitzt Potential, den zugrunde liegenden Mechanismus und die beeinflussenden Faktoren im Detail aufzuklären und darüber hinaus auch die Möglichkeit auf Pflanzenviren weiterer Familien anwendbar zu sein.
