Posttranslationale Bildung von Ca-Formylglycin in eukaryonten Sulfatasen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im ER werden neu synthetisierte Sulfatasen durch das Formylglycin-generierende Enzym (FGE) modifiziert, wobei die Methylenthiol-Seitenkette eines konservierten Cysteins in eine Formaldehydgruppe eines Formylglycins umgewandelt wird. Das neu entstandene Formylglycin befindet sich nach der Faltung der Sulfatase im aktiven Zentrum und katalysiert dort die Spaltung der Sulfatesterbindung der Substrate. Mutationen im FGE-Gen (SUMF1) sind die Ursache für die Multiple Sulfatasedefizienz (MSD), bei der die katalytische Aktivität aller Sulfatasen vermindert ist. Nach der Identifizierung des FGE-Gens konnten wir in Rahmen des DFG-Projektes das Protein stabil in humanen Zellinien exprimieren und für die biochemische Charakterisierung und die Röntgenstrukturanalyse reinigen. Den Ergebnissen zufolge ist FGE eine Monooxygenase, die für die Oxidation der Cysteinseitenkette molekularen Sauerstoff verwendet. Im Gegensatz zu den meisten anderen Monooxygenasen venwendet FGE jedoch keine Kofaktoren wie Metallionen oder Pyrimidinnukleotide, ist aber von der Zufuhr Thiol-basierter Reduktionsäquivalente abhängig. Im Kristall zeigt FGE eine globuläre Struktur mit einer Substratbindungsstelle, die zwei katalytisch aktive Cysteine enthält. Auf der Basis der Redoxeigenschaften dieser Cysteine konnte ein Modell für den Mechanismus der Katalyse entwickelt werden. Für eine Reihe von Missense-Mutationen, die zu MSD führen, wurden auf Basis der Kristallstruktur Strukturänderungen vorausgesagt und deren Auswirkungen auf Stabilität und Aktivität des FGE-Moleküls im Zellkultursystem getestet. Die N-terminale Domäne des FGE (Aminosäuren 34-72), für die keine Kristallstrukturdaten vorliegen, erwies sich als essentiell für die in vivo-Aktivität und die Bindung an das ER-Protein ERp44, das die Retention des FGE im ER vermittelt. Die biochemische und die Röntgenstrukturanalyse des dem FGE homologen pFGE (paralog of FGE) zeigte eine große Strukturähnlichkeit mit FGE und wie für FGE die Eigenschaft Sulftasepeptide zu binden. Eine katalytische Aktivität zur Bildung von Formylglycin konnte für pFGE jedoch nicht nachgewiesen werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Defects in lysosomal enzyme modification for catalytic activity. In: Lysosomal Disorders of Brain (Piatt, F. M & Walkley, S. U., Eds.), Oxford University Press, Oxford, pp. 131-140.(2004)
von Figura, K., Borissenko, L. V., Fey, J., Peng, J., Schmidt, B. and Dierks, T.
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Crystal structure of human pFGE, the paralog of the Ca-formylglycine-generating enzyme. J. Biol. Chem. 280, 15180-15187 (2005)
Dickmanns, A., Schmidt, B., Rudolph, M., Mariappan, M., Dierks, T., von Figura, K. and Ficner, R.
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Expression, localization, structural, and functional characterization of pFGE, the paralog of the Ca-formylglycinegenerating enzyme. J. Biol. Chem. 280, 15173-15179 (2005)
Mariappan, M., Preusser-Kunze, A., Balleininger, M., Eiselt, N., Schmidt, B., Gande, S. L., Wenzel, D., Dierks, T. and von Figura, K.
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Molecular basis for multiple sulfatase deficiency and catalytic mechanism for formylglycine generation of the human formylglycine generating enzyme. Cell 121. 541-552 (2005)
Dierks, T., Dickmanns, A., Preusser-Kunze, A., Schmidt, B., von Figura, K., Ficner, R. and Rudolph, M.
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Molecular characterization of the Human Ca-formylglycine-generating enzyme. J. Biol. Chem.280, 14900-14910 (2005)
Preusser-Kunze, A., Mariappan, M., Schmidt, B., Gande, S. L., Mutende, K., Wenzel, D., von Figura, K. and Dierks, T.
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A general binding mechanism for all human sulfatases by the formylglycine-generating enzyme. PNAS 103, 81-86 (2006)
Roeser, D., Preusser-Kunze, A., Schmidt, B., Gasow, K., Wittmann, J. G., Dierks, T, von Figura, K., and Rudolph, M. G.
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Molecular Analysis of SUMF1 Mutations: Stability and Residual Activity of Mutant Formylglycine-Generating Enzyme Determine Disease Severity in Multiple Sulfatase Deficiency. Human Mutations 986 (2007)
Schlotawa, L.,Steinfeld, R., von Figura, K., Dierks, T. and Gärtner, J.
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ERp44 Mediates a Thiol-independent Retention of Formylglycine-generating Enzyme in the Endoplasmic Reticulum. J. Biol. Chem. 283, 6375-6383 (2008)
Mariappan, M., Radhakrishnan, K., Dierks, T., Schmidt, B., and von Figura, K.
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Paralog of the Formylglycine-generating Enzyme - Retention in the Endoplasmic Reticulum by Canonical and Noncanonical Signals. FEBS Journal 275,1118-1130 (2008)
Gande, S. L., Mariappan, M., Schmidt, B., Pringle, T. H., von Figura, K., and Dierks, T
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The Non-catalytic N-terminal Extension of Formylglycine-generating Enzyme Is Required for its Biological Activity and Retention in the Endoplasmic Reticulum. J. Biol. Chem. 283, 11556-11564 (2008)
Mariappan, M., Gande, S. L., Radhakrishnan, K., Schmidt, B.. Dierks, T, and von Figura, K.
