Palmitoylierung von Gas
Zusammenfassung der Projektergebnisse
2.1. Allgemeinverständliche Darstellung der wesentlichen Ergebnisse und der erzielten Fortschritte gegenüber dem Stand des Wissens zum Zeitpunkt der Antragstellung Für die Beschreibung der Funktion einer Zelle ist neben dem Vorhandensein der genetischen Information vor allem das Expressionsmuster in zeitlicher und quantitativer Auflösung aussagekräftig, und eng verbunden damit auch die Lokalisation der Expressionsprodukte. Dieser letzte Aspekt wird in der systembiologischen Proteomforschung erst wenig berücksichtigt. Die Proteinlokalisation wird bestimmt durch die Interaktion des Proteins mit anderen Zellstrukturen, hauptsächlich mit anderen Proteinen, die wiederum grundlegend durch Modifikationen an den beteiligten Proteinen determiniert werden. Neben den schon lange bekannten Phosphorylierungen von Proteinen erfahren zunehmend Lipidmodifikationen an Proteinen steigende Aufmerksamkeit. Am Beispiel von Gets sollte in dem beantragten Projekt eine besonders interessante Acylierung untersucht werden, die Palmitoylierung: Gets wird sowohl reversibel am CysteinS palmitoyliert (-> Thioester, S-Palm-Gos) als auch quasi-irreversibel am Glycin2 (-> Amid, N-Palm-Gcis). Die S- und N-Palmitoyiierungen scheinen sich beide in ihrer quantitativen Ausprägung und Kinetik gegenseitig zu beeinflussen und bedingen offensichtlich Änderungen der Gas-Funktion als Signaltransmitter. i. Mechanismus der Gr^-N-PalmitovIieruna: In einem ersten Schritt konnte für die der N-Palmitoylierung zugrundeliegenden Reaktion ausgeschlossen werden, daß irgendeine der bisher identifizierten Myristoyltransferasen (hefespezifische NMT1 yNMT1, hefespezifische NMT2 yNMT2, humane NMT hNMT) den Palmitoyl-Rest von Palmitoyl-Coenzym A auf das N-terminale Glycin des Gas überträgt. Aufgrund einer im Vergleich zur yNMT weniger stark ausgeprägten Substratspezifität der hNMT erkannte diese zwar Gets, übertrug aber nur einen Myristoylrest. yNMT dagegen transferierte ausschließlich eine Myristoylgruppe auf Go, oder Goto- Durch Mutation von Asparagin6 des Gets in Serin wurde Glycin2 myristoyliert (Darstellung im heterologen Bakterien system und im Säugersystem mit MS/MS-Analyse). N-Myristoyliertes N6S-Gos stimulierte die Adenylylcyclase jedoch weniger potent als N-palmitoyliertes Gas. N-myristoyliertes natives Gets konnte mit einem verbesserten Nachweissystem in geringen Mengen in vivo nachgewiesen werden (MS/MS-Analyse). Die Änderung der Lip id m öd if i kation am N-Terminus von Gets beeinflußte die Signaltransduktion von Gas auf Adenylylcyclase in vitro und in vivo, schien sich jedoch überraschenderweise weniger auf die Rezeptor-vermittelte (ßAR) Stimulation der Adenylylcyclase auszuwirken. Die Auswirkung der Ga-Acylierung auf die Rezeptor-Kopplung sollte im ROS-System mit Rhodopsin dargestellt werden, gelang jedoch wegen der Kopplungsselektivität nur mit Transducin, Gctj und Goto. Die individuellen Reaktionsschritte der gekoppelten Gleichgewichtsreaktionen, die letztendlich zur lichtinduzierten Dissoziation des G-Proteins und Rezeptorinaktivierung führen, wurden isoliert und auch hintereinandergeschaltet mit diesen 3 Proteinen dargestellt und ergaben deutliche Abhängigkeiten vom Lipidmodifikationszustand der G-Protein-Untereinheiten. An diesen 3 Proteinen der Gj-Familie konnte gezeigt werden, daß die G-Protein / Rezeptorkopplung abhängig ist von der Lipidmodifikation des Heterotrimers, wobei Isoprenylierung der G-y- Untere! n he it und Acylierung der G a-Untereinheit alleine ausreichten und eine fehlende Lipidmodifikation der jeweils anderen Untereinheit kompensieren konnten. Allerdings wurden diese Gleichgewichte zusätzlich durch die individuelle Aminosäuresequenz der Ga- und Gy, nicht aber der Gß-Untereinheit moduliert, so daß ein Analogschluß dieser Ergebnisse für das Gas-System obsolet war. Es konnten bisher keine überzeugenden Daten erhalten werden, die eine nicht-enzymatische Transpalm itoylierung von CysteinS auf Glycin2 unterstützten. Massenspektrometrisch konnte jedoch weder an der in Säugerzellen überexprimierten G2A-, noch der C3S-Mutante eine N-terminale Palmitoylierung nachgewiesen werden. Diese Befunde sind vereinbar mit einer mechanistischen Involvierung von CysteinS im Falle einer (nicht-enzymatischen) Transpalm itoylierung, aber auch mit einer Enzym-vermittelten direkten Pal m itoylierung mit einer Erkennungssequenz Glycin2-Cystein3. ii. Lokalisation und Transportvoroänae von N-Palm-Ga^: Es konnten zell- und gewebespezifische Verteilungsmuster von Gas dargestellt werden, in denen Gag in Membranmikrodomänen angereichert ist, jedoch war keine Abhängigkeit dieser Anreicherung vom Lipidmodifikationsstatus von Gas erkennbar. Aufgrund der komplizierten Aufarbeitungsmethode (Ausschluß von S-Palm-Gos) waren diese Daten jedoch vorsichtig zu interpretieren und sollten mit Fluoreszenzstudien komplettiert werden. Leider gelang es nicht, die bei Prof. Waldmann etablierte Methode für die Lipid-Fluoreszenz-Markierung monomerer G-Proteine auf Go, oder Gas zu adaptieren (schlechter Einbau, Ga war nach Beendigung der Aufreinigung aus der Lipidkopplung nicht mehr aktiv). Die Synthese hätte für Ga neu aufgebaut werden müssen, wofür die zur Verfügung stehende Zeit nicht ausreichte. iii. Regulation und Interaktion von N-Palm-Gn^: Der Einfluß regulatorischer Prozesse auf den Acylierungszustand von Gets wurde in einem Zellkultur-Modell getestet (Dauerstimulation des ß-adrenergen bzw. Somatostati n-Rezeptors). Erste Ergebnisse zeigten keine Änderung des Palmitoylierungszustandes von Gotg. Allerdings wurden hier weder Informationen über den Desensitisierungsgrad des Systems verarbeitet noch verschiedene Zeitfenster untersucht. Auch Stellglieder unterhalb der Rezeptorebene wurden noch nicht mit einbezogen. Für die Adenylylcyclase konnte gezeigt werden, daß Gas mit beiden cytosolischen Hälften des Enzyms interagierte und eine weitere, hydrophobe Tasche in den Transmembrandomänen des Effektors nutzt. Die Interaktion des N-Palmitoylrestes am Gas mit der Adenylylcyclase erfolgt ebenfalls mit den Transmembrandomänen des Effektors, scheint aber different zu sein zu der Stelle des Myristoylrestes. 2.2. Ausblick auf künftige Arbeiten und Beschreibung möglicher Anwendungen. Mit Ablauf des Jahres 2005 bin ich aus dem befristeten Arbeitsverhältnis im öffentlichen Dienst der Charite ausgeschieden, führte danach auf Basis eines G astwissen schaftler-Vertrages mit Prof. Rosenthal und der Charite meine Arbeiten noch 6 Monate unentgeltlich weiter bis zu dem hier dargestellten Stand. Meine damaligen Doktoranden beendeten ihre praktischen Arbeiten im November 2006, an der schriftlichen Darstellung ihrer Experimentalphase arbeiten sie z.T. (Frau Klass) immer noch. Am 1. Juli 2006 schloß ich einen Arbeitsvertrag mit einem Biotechnologie-Unternehmen im Impfstoffbereich. Zusammen mit meinem neuen Beschäftigungsverhältnis haben sich auch meine wissenschaftlichen Interessen geändert, so daß ich keine weiteren Arbeiten in dem Gebiet der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion plane.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Diel et al.: Jahrestagung der Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie 2004: Neue Aspekte der Adenylylcyclase-Regulation: Die C1b Domäne als Zielscheibe Isoform-spezifischer Aktivatoren
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Diel et al.: Jahrestagung der Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie 2005: Gßy Stimulation of adenylyl cyclase type II
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Diel, S., Klass, K., Wittig, B., Kleuss, C.: Gßy activation site in Adenylyl Cyclase Type II. J. Biol. Chem. 281,288-294(2006).
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Dissertation Dipl.-Chem. Susanne Diel: Isoform -spezifische Regulation der Säuger- Adenylylcyclasen ACi und ACH durch Calcium/Catmodulin und Gßy.
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Dissertation Dipl.-Pharm. Hendrik Falk: Bedeutung der Gas-Spleißvarianten für die Signaltransduktion zur Adenylylcyclase.
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Habil CK: Signaltransduktion durch heterotrimere G-Proteine; Fettsäuren als Informationsträger Jan 2005
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Herrmann R., Heck M., Henklein P., Kleuss C., Wray V, Hofmann K.-P., Ernst O.P.: Vision Res. 46, 4582-4593 (2006).
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Klass et al.: Jahrestagung der Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie 2004: A Gots-specific RGS in mouse
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Klass et al.: Jahrestagung der Gesellschaft für Signaltransduktion, Nov. 2005 in Weimar: Identification of novel Gets-interacting proteins
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Kleuss et al.: Jahrestagung der Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie 2005, üpidmodifikationen an G-Proteinen
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Kleuss, C.: G-Protein y8, Protein ID A000996. AfCS-Nature Molecule Page (2007) (Siehe online unter: doi:10.1038/mp.a000996.01 ; http://www.siqnalina-qatewav.ora/molecule/querv7afcsidsAQ00996)
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Kleuss, C.: G-Protein ß4. Protein ID A000985. AfCS-Nature Molecule Pages (2005). (Siehe online unter: doi:10.1038/mp.a000985.01; http://www.signaling-gateway.org/molecule/query7afcsidsA000985)
