Elucidation of chemical interactions of Verticillium longisporum with Brassica napus

• Antragsteller: Professor Dr. Petr Karlovsky
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenzüchtung, Pflanzenpathologie ; Organismische Interaktionen, chemische Ökologie und Mikrobiome pflanzlicher Systeme
• Förderung: Förderung von 2004 bis 2012
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 5471048

• Erstellungsjahr: 2012

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Unser Ziel war es, chemische Interaktionen zwischen V. longisporum und B. napus zu beleuchten und Virulenzfaktoren des Pilzes zu charakterisieren. In der ersten Phase haben wir Xylemmetaboliten detektiert, deren Konzentrationen sich nach Infektion ändern, und pilzliche Transkripte identifiziert, die durch Behandlung mit Xylem induziert wurden. Unter diesen Kandidaten sollten an Pathogenabwehr beteiligte Metaboliten und Gene für pilzliche Virulenzfaktoren gesucht werden. Im Xylemsaft von B. napus haben wir Salicylsäure (SA) und SA Glycosid (SAG) identifiziert, Infektion mit V.l. führte zur Erhöhung ihrer Konzentrationen. SA und SAG wurde zum ersten Mal im Xylemsaft einer Pflanze gefunden. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass Aufwärtstransport von SA via Xylem zur Redistribution von SA nach biotischem Stress beiträgt. Beziehungen zwischen SA, SAG, Phytohormonen, Krankheitssymptomen und dem Gehalt an pilzlicher DNA wurden charakterisiert. Um die Struktur weiterer Xylemmetaboliten zu bestimmen, wurde Xylemsaft aus über 7.000 infizierten Pflanzen gewonnen, ein Metabolit (MW von 612) wurde 42-mal angereichert. Diese Arbeit wurde seit dem Abschluss von FOR546 fortgesetzt. Bestimmung der Expression von V.l.-Genen in planta und Unterdrückung der Gen- expression mittels RNAi und Antisense-RNA wurde etabliert. Die Methoden wurden auf Kandidatengene angewendet. Die interessantesten Phänotypen zeigten RNAi-Konstrukte für Vl_6.2 (Integrität der Zellwand), PKS1 (Polyketidsynthase) und VlNEP-1 (NEP- ähnliches Protein). Alle drei Gene werden in planta stark induziert. Das Produkt von Vl_6.2 bindet vermutlich Polysaccharide, RNAi-Mutanten zeigen reduzierte Virulenz und eine erhöhte Empfindlichkeit gegen Tenside. PKS1-Mutanten zeigten unveränderte Virulenz, eine verzögerte Pigmentation auf Agar und Verlust der Farbstoffbildung in Kartoffelextrakt-Medium. Außerdem wurde ihre kompetitive Fitness beeinträchtigt. VlNEP-1 Mutanten zeigten reduzierte Virulenz, gereinigtes VlNEP-1 Protein war phytotoxisch für B. napus und A. thaliana. Histologische Untersuchungen zeigten, dass das Protein im Xylem freigesetzt wird und umliegendes Gewebe infiltriert. Unsere Hypothese ist, dass VlNEP-1 Protein den Nährstoffgehalt im Xylem erhöht, indem es Membranen von benachbarten Zellen permeabilisiert. Als Service und im Rahmen der Zusammenarbeit mit anderen Arbeitsgruppen haben wir die Bestimmung der Pilzbiomasse im Pflanzengewebe etabliert, markierte V.l.-Stämme konstruiert, Bioassays mit Xylem-Fraktionen durchgeführt, Kulturüberstände von V.l. für Bioassays mit A. thaliana fraktioniert und Perl-Skripte für Datenprozessierung für die Datenprozessierung bei cDNA-AFLP-Untersuchung an B. napus geschrieben.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• (2008) Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biol 8: 129
  Floerl S, Druebert C, Majcherczyk A, Karlovsky P, Kües U, Polle A
  
• (2008) Improved coverage of cDNA-AFLP by sequential digestion of immobilized cDNA. BMC Genomics 9: 480
  Weiberg A, Pöhler D, Morgenstern B, Karlovsky P
  
• (2008): Development and application of LC-MS-based differential metabolic profiling in plant systems. PhD thesis
  Astrid Ratzinger
  
• (2008): Identification of genes induced in the vascular pathogen Verticillium longisporum by xylem sap metabolites of Brassica napus using an improved genome-wide quantitative cDNA-AFLP. PhD thesis
  Arne Weiberg
  
• (2009) Components of variance in transcriptomics based on electrophoretic separation of cDNA fragments (cDNA-AFLP). Electrophoresis 30: 2549–2557
  Weiberg A, Karlovsky P
  
• (2009) Internal resistance in winter oilseed rape inhibits systemic spread of the vascular pathogen Verticillium longisporum. Phytopathology 99: 802–811
  Eynck C, Koopmann B, Karlovsky P, von Tiedemann A
  
• (2009) Salicylic acid and salicylic acid glucoside in xylem sap of Brassica napus infected with Verticillium longisporum. J Plant Res 122: 571–579
  Ratzinger A, Riediger N, von Tiedemann A, Karlovsky P
  
• (2010) Genetic and environmental control of the Verticillium syndrome in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol 10: 235
  Häffner E, Karlovsky P, Diederichsen E
  
• (2010): Determination of fungal gene expression in planta by qRT-PCR and characterization of putative pathogenicity related genes of Verticillium longisporum. PhD thesis
  Haiquan Xu
  
• (2011): Molecular and functional characterization of potential pathogenicity related genes from Verticillium longisporum. PhD thesis
  Malte Beinhoff
  
• (2012) The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant Microbe Interaction 25, 569-581
  Singh S, Braus-Stromeyer SA, Timpner C, Valerius O, von Tiedemann A, Karlovsky P, Druebert C, Polle A, Braus GH