Identifizierung tumoraffiner Peptide zur nuklearmedizinischen Therapie von Schilddrüsenkarzinomen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Arbeiten in diesem Projekt beschäftigten sich mit der Identifizierung von Peptiden mit Affinität für Schilddrüsenkarzinome und HNO-Tumoren. Das Peptid FROP-1 wurde mit einer 12 Aminosäure Peptid-Phagen Display Bibliotek identifiziert. Dazu wurden follikuläre Schilddrüsenkarzinomzellen mit der Bibliothek inkubiert und das nach 5 Selektionsrunden angereicherte Motiv (EDYELMDLLAYL) synthetisiert und in vitro sowie in vivo in einer Reihe von Tumorzell-Linien charakterisiert. Das neue Peptid FROP-1 zeigte Bindung an Zell-Linien vom follikulären Schilddrüsenkarzinom, anaplastischen Schilddrüsenkarzinom, Mammakarzinom, Zervixkarzinom, Prostatakarzinom und HNO-Tumoren aber nur eine geringe Bindung an humane Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) oder immortalisierte Keratinozyten. Bei MCF7 (Mammakarzinom) Zellen waren 78% bzw. 86% der gebundenen Aktivität nach 10 bzw. 60 Minuten Inkubation internalisiert. Stabilitätsexperimente in humanem Serum zeigten nach 15 Minuten ein erstes Abbauprodukt. Der Tumor Uptake des Peptids in Nacktmäusen stieg bis zu 45 Minuten nach Tracer-Applikation an mit ~3.6% ID/g für FRO82-2 Tumoren und ~3.8% ID/g für MCF-7 Tumoren. In weiteren Experimenten wurde FROP-1 an den Chelator DOTA gekoppelt und mit 111-In markiert. Die entstehenden strukturellen Veränderungen konnten dann mittels ‘circular dichroism’ untersucht werden. Weiterhin wurden die Eigenschaften des Tracers in vitro und in vivo näher untersucht. Im Vergleich zum Peptid ohne Chelator zeigte FROPDOTA eine deutlich unterschiedliche zelluläre Aufnahmekinetik mit einem Maximum nach 2 h. Die Zellen reicherten den Tracer vollständig an; Kompetitionsexperimente ergaben eine signifikante Hemmung der Traceranreicherung als Hinweis auf die Spezifität der Bindung. Die Internalisierungskinetik, gemessen in MCF-7 Zellen, zeigte, daß nach einer Inkubationszeit von 180 min die Hauptfraktion der Radioaktivität intrazellulär vorlag. Stabilitätsexperimente mit humanem Serum ergaben eine durch den Chelator gesteigerte Stabilität mit einer Halbwertszeit von 71 min. In Circular Dichroism Messungen wurde eine feste alpha helicale Struktur von FROPDOTA als Hinweis auf eine deutliche Änderung der Sekundärstruktur gefunden. Kompetitionsexperimente ergaben eine Bindungskonstante (KD) für FRO82-2 Zellen von 494 nM. Trotz dieser hohen Bindungsaffinität lag jedoch eine sehr langsame Bindungskinetik vor, die zusammen mit einer sehr schnellen Clearance einen signifikanten Uptake in vivo verhinderte. Die Bioverteilung in tumortragenden Mäusen zeigte eine schnelle renale und hepatobiliäre Clearance mit schnelle abfallenden Blutspiegel: von 5.48 ±0.26 %ID/g fünf min p.i. auf 0.77 ± 0.15 %ID/g 135 min p.i.. Die Tatsache, dass das Peptid an eine Reihe verschiedener Tumore bindet, macht das Molekül zu einer interessanten Struktur. Dennoch sind weitere Modifikationen zur Steigerung von Affinität und Stabilität bzw. zur Optimierung der Plasmahalbwertszeit nötig. Ferner wurde ein Panning an HNO-Tumorzellen durchgeführt und das HNO- Tumorzell bindende Peptid HBP-1 nach 5 Runden mit HNO223 Tumorzellen selektioniert. Anschließend wurde HBP-1 und sein Derivat HBP-1-s mittels Fmoc Festphasensynthese hergestellt. Für in vitro Studien wie Kinetiken, Kompetitionsexperimente und Bindungsstudien mit 5 verschiedenen HNO- 125 Tumorzelllinien wurden die Peptide mit I markiert. Darüber hinaus wurde die 131 Peptidstabilität in humanem Serum getestet. Die in vivo Organverteilung des I- markierten Peptids wurde mit tumortragenden Nacktmäusen bestimmt. Diese Ergebnisse wurden mit humanen Tumorschnitten und fluoreszenz-markiertem HBP-1 weiter evaluiert. Für die Ermittlung der Bindungssequenz und der Zielstrukturvalidierung wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt. Die Sekundärstrukturelemente von HBP-1 und ausgewählten Derivaten wurden mit Hilfe des Circularen Dichroismus (CD) bestimmt. HBP-1 zeigte eine spezifische Bindung an 5 verschiedene PEK-KHB Zelllinien mit einem Maximum von 11% und einem IC50-Wert von 38.9 nM bei HNO97-Zellen. Stabilitätsexperimente in humanem Serum ergaben eine t1/2 von 55 min. In zwei verschiedenen HNO-Xenotransplantaten reicherte sich 131I-HBP-1 schnell und bis zu 45 min nach Applikation stabil an. Eine Peptid-histochemie mit HNO-Tumorschnitten wies eine Färbung der Tumorzellen aber nicht des Normalgewebes auf. Sequenzmutationen und Kompetitionsexperimente brachten die äußerst wichtige Beteiligung des RGD-Motivs in Kombination mit dem LXXL-Motiv für die Bindungskapazität an Licht. Das RGDLXXL-Motiv von HBP-1 weist auf eine Bindung an den avß6 und nicht den RGD-Motiv üblichen avß3 Integrin-Rezeptor hin. Die CD- Untersuchungen ergaben eine starke Sekundärstrukturkomponenten-Beteiligung an der Bindungskapazität des HBP-1. Der Austausch des N-terminalen Serins führte zu einer 3.5 Mal höheren Serumstabilität und einer 10 Mal besseren IC50-Wert von 3.7 nM für das Derivat HBP-1-s. Organverteilungsstudien mit dieser Variante zeigten allerdings bisher keine verbesserte Tumoraufnahme. HBP-1 und das stabilere Derivat HBP-1-s repräsentieren vielversprechende Ausgangsmoleküle für die Entwicklung von zielgerichteten Therapien oder diagnostische Verfahren für Patienten mit HNO-Tumoren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Identification and Evaluation of a New Tumor Cell-Binding Peptide, FROP-1. J Nucl Med 2007;48:965-972
Zitzmann S, Kramer S, Mier W, Hebling U, Altmann A, Rother A, Berndorff D, Eisenhut M, Haberkorn U
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Influence of Chelate Conjugation on a Newly Identified Tumor-Targeting Peptide. J Nucl Med 2007;48:1545-1552.
Mier W, Zitzmann S, Kramer S, Reed J, Knapp EM, Altmann A, Eisenhut M, Haberkorn U
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Identification and Characterization of a Peptide with Affinity to Head and Neck cancer. J Nucl Med 2009;50(3):426-34
Nothelfer EM, Zitzmann-Kolbe S, Garcia-Boy R, Krämer S, Herold-Mende C, Altmann A, Eisenhut M, Mier W, Haberkorn U
