Entschlüsselung der genregulatorischen Funktion der langen nicht-kodierenden RNA Maenli

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Mundlos
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 577404682

Das nicht-kodierende Genom von Wirbeltieren wird umfassend transkribiert und die Mehrheit dieser Sequenzen ist vermutlich an der Genregulation beteiligt. Eine Untergruppe dieser Transkripte sind lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), die ursprünglich als Transkripte mit einer Länge von mehr als 200 bp definiert wurden, die keinen offenen Leserahmen enthalten. Wie mRNAs werden diese Transkripte gespleißt und polyadenyliert. Obwohl sie nur wenig konserviert sind, haben lncRNAs oft entscheidende evolutionär konservierte Funktionen und sind wichtige Komponenten des genregulatorischen Netzwerks. In einer früheren Studie haben wir die lncRNA Maenli als Hauptregulator der En1-Expression in den Gliedmaßen identifiziert. Mutationen, die Maenli betreffen, führen bei Menschen und Mäusen zu einem komplexen Gliedmaßenphänotyp (Allou et al. Nature 2021). Unsere Studien zeigten, dass Maenli En1 in cis reguliert, aber es bleibt unklar, wie es En1 aktiviert und wie seine Funktion in die 3D-Chromatinlandschaft des Locus eingebettet ist. Wir werden die genregulatorische Funktion von lncRNAs am Beispiel von Maenli in vivo in der Maus untersuchen. Zu diesem Zweck verwenden wir modernste Technologien der Genomtechnik und der synthetischen Biologie. In Ziel 1 werden wir den Maenli-Locus von ca. 25 kb in verschiedenen Variationen (Konstrukte 1-7) in Hefe synthetisch herstellen. Das TAR-System verwendet die homologe Rekombination von 2-3 kb-Fragmenten in Hefe, um synthetische DNA-Fragmente von bis zu 50 kb herzustellen, die dann von der Hefe in einem BAC übertragen werden. In Ziel 2 werden wir das synthetisch hergestellte Fragment, das den gesamten Maenli-Locus enthält, in einen Maenli-Deletions-Maus-ES-Zellklon einfügen. Dies wird durchgeführt, indem zuerst ein landing pad und dann das Fragment mit Bxb1-Integrase eingefügt wird. Aus diesen Zellen werden Mäuse hergestellt. In Ziel 3 werden wir die Locus-Spezifität der Maenli-lncRNA untersuchen. Wir werden Maenli außerhalb des En1 TAD einfügen, um zu sehen, ob die Funktion von Maenli von der 3D-Konformation des Locus abhängt. In Ziel 4 werden wir testen, ob der menschliche MAENLI-Locus den Maus-Phänotyp retten kann. Zu diesem Zweck werden wir die in unserer ersten Studie bei Patienten identifizierte menschliche 27-kb-Deletion synthetisieren und in das Mausgenom einfügen. In Ziel 5 wollen wir die einzelnen Komponenten der Maenli-Funktion, d. h. den Promotor, das Spleißen und das Vorhandensein von Poly-A-Stellen, analysieren. Zunächst werden wir den Maenli-Promotor durch einen BMP2-Enhancer ersetzen, um zu testen, ob wir die En1-Expression auf BMP2-ähnliche Weise steuern können. Zweitens werden wir Konstrukte ohne Introns und ohne Polyadenylierung erstellen. Diese Konstrukte werden erneut in den wt-Locus eingefügt. Die Auswertung erfolgt für alle Konstrukte: En1-Expression bei E10,5 und Phänotyp bei E17,5. Die Mäuse werden mit unserem bewährten ES-Zell-Aggregationssystem erzeugt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen