Posttranskriptionelle Kontrolle der Genexpression des bHLH-Transkriptionsfaktors Mash1
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des Forschungsprojekts sollte die Regulation des basischen helix-loop-helix Transkriptionfaktors hASH1 (human achaete-scute homolog-1), der durch das ASCL1 Gen kodiert wird, untersucht werden. Phänotypanalysen an Mausmutanten mit Inaktivierung von Mash1, dem murinen Homolog von hASH1, hatten ergeben, dass dieser Transkriptionsfaktor für die neuronale Differenzierung im autonomen Nervensystems und für die Entwicklung neuronaler Progenitorzellen, vor allem des ventralen Telenzephalons und Riechepithels, eine zentrale Rolle spielt. Während hASH1 in terminal differenzierten Nervenzellen allenfalls geringgradig exprimiert wird, findet sich ein hohes Expressionsniveau in neuroendokrinen Tumoren und in Neuroblastomen mit besonders ungünstigem klinischem Verlauf. Das lokale Sauerstoffangebot gilt – unabhängig von einer Beeinflussung der Angiogenese – als ein kritischer Faktor für die Progression und histologische Malignität neuronaler Tumoren. Vor diesem Hintergrund war es auch aus medizinischer Sicht von Interesse, die Auswirkungen von Sauerstoffmangel (Hypoxie) auf die Regulation des ASCL1 Gens in Neuroblastomzellen zu untersuchen. Im Vergleich zu Normoxie (21% O2) bewirkte die Inkubation von Kelly-Neuroblastomzellen bei 1% O2 innerhalb von 3 Stunden eine signifikante Hemmung der ASCL1 Genexpression. Während die ASCL1 mRNA (qPCR) unter hypoxischen Bedingungen (1% O2) nach 24 Stunden auf 45% der Kontrollwerte (21% O2) abnahm, war die hASH1 Proteinmenge (Immunoblot) sogar bis auf 20% reduziert. Der stärkere Effekt einer Hypoxie auf Protein- als auf mRNA-Ebene lieferte einen ersten Hinweis, dass Sauerstoffmangel die Expression des ASCL1 Gens hauptsächlich über einen posttranskriptionellen Mechanismus hemmt. Dies konnte mittels Reportergen-Assays, bei denen eine Firefly-Luziferase unter Kontrolle der ASCL1 mRNA 5’- und 3’-UTRs in Kellyzellen exprimiert wurde, bestätigt werden. Sowohl über die ASCL1 mRNA 5’-UTR als auch über die 3’-UTR wurde im Untersuchungszeitraum zwischen 3 und 48 Stunden eine Hemmung der Luziferase mRNA und der Luziferaseaktivität durch Inkubation bei 1% O2 vermittelt. Hingegen konnte ein hemmender Einfluss auf den ASCL1 Promotor nur nach prolongierter Hypoxieexposition festgestellt gestellt werden. Durch Kombination von RNA Pulldown-Assays mit nachfolgender MALDI/TOF-Massenspektrometrie wurden die heterogenen nukleären Ribonucleoproteine (hnRNP)-A2/B1 und hnRNP-R als ASCL1 mRNA 5’- und 3’-UTR bindenden Moleküle identifiziert. Die Transfektion mit spezifischen siRNAs ergab eine signifikante positive Korrelation von ASCL1/hASH1 sowohl mit hnRNP-A2/B1 als auch mit hnRNP-R in Kelly-Zellen. Diese Resultate zeigten, dass die Synthese von hASH1 durch hnRNP- A2/B1 und hnRNP-R unter normoxischen Bedingungen (21% O2) stimuliert wird. Somit stellte sich die Frage, ob eine verminderte Expression von hnRNP-A2/B1 und/ oder hnRNP-R möglicherweise Ursache für die durch Hypoxie ausgelöste Hemmung der hASH1 Synthese war. Tatsächlich bewirkte die Inkubation bei 1% O2 eine signifikante Abnahme der hnRNP-A2 und vor allem der hnRNP-B1 Proteinmenge in Kelly-Zellen. Weiterhin wurde der hemmende Einfluss von Sauerstoffmangel auf die hASH1 Synthese durch Silencing von hnRNP-A2/B1 und – in geringerem Maße – von hnRNP-R signifikant verstärkt. Die forcierte Überexpression von hnRNP-B1 bewirkte eine signifikante Zunahme von hASH1 Protein bei 21% O2 und verhinderte die Reduktion von hASH1 Protein unter Hypoxie (1% O2). Die Analyse der ASCL1 mRNA 5’-UTR ergab ein GA-reiches Element als potentielle hnRNP-A2/B1 Bindungsstelle. Eine Deletion dieses cis-Elements verhinderte die Interaktion von hnRNP-A2/B1 mit der ASCL1 mRNA 5’-UTR und bewirkte einen Verlust der stimulierenden Wirkung von hnRNP-A2/B1 auf die ASCL1 mRNA 5’-UTR in Reporterassays. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Sauerstoffmangel die Expression des ASCL1 Gens vorwiegend auf post-transkriptioneller Ebene hemmt. Als ein wichtiger Vermittler dieser Hypoxiewirkung wurde hnRNP-A2/B1 identifiziert, welches die hASH1 Synthese durch Bindung an ein GA-reiches cis- Element in der ASCL1 mRNA 5’-UTR stimuliert und bei Sauerstoffmangel herabreguliert wird. Interessanterweise reagierten auch primäre Neurone aus den Cortices von Rattenembryonen (E19) auf Sauerstoffmangel (0,5% O2) mit einer Abnahme der Mash1 Synthese. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass der von uns beschriebene molekulare Mechanismus der ASCL1 Genexpressionskontrolle unter Hypoxie nicht nur in der Pathogenese neuronaler Tumoren sondern möglicherweise auch für die Differenzierung von Nervenzellen während der Gehirnentwicklung eine Rolle spielt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009) "Translational regulation of the human Achaete-Scute Homologue-1 (hASH1) by Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP)." J Biol Chem. 284(7):4255-66
Fähling,M., R.Mrowka, A.Steege, K.M.Kirschner, E.Benko, B.Förstera, P.B.Persson, B.J.Thiele, J.C.Meier and H.Scholz
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(2011) “Oxygen-Dependent Gene Expression in Development and Cancer: Lessons Learned from the Wilms' Tumor Gene, WT1”. Front Mol Neurosci. 4:4
Scholz H, Kirschner KM
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(2011) “Phorbol-Ester Mediated Suppression of hASH1 Synthesis: Multiple Ways to Keep the Level Down”. Front Mol Neurosci. 7;4:1
Benko E, Winkelmann A, Meier JC, Persson PB, Scholz H & Fähling M
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(2011) “Posttranscriptional control of the hypoxic response by RNA-binding proteins and microRNAs“. Front Mol Neurosci. 4:7
Gorospe M, Tominaga K, Wu X, Fähling M, Ivan M
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(2014) „Shut Down of Achaete-Scute Homolog-1 Expression by Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein (hnRNP)-A2/B1 in Hypoxia”. J Biol Chem. pii: jbc.M114.579391
Kasim M, Benko E, Winkelmann A, Mrowka R, Staudacher JJ, Persson PB, Scholz H, Meier JC & Fähling M
