The function of UBEIL2, a novel ubiquitin specific activating enzyme (E1)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Modifikation von Proteinen mit Ketten von dem kleinen Protein Ubiquitin markiert diese für den Abbau durch das Proteasom. Ein Ubiquitin-ähnlicher Modifikator, der genau wie Ubiquitin Substratproteine zum Abbau durch das Proteasom führt, ist FAT10. FAT10 wird durch die entzündungsfördernden Zytokine Interferon(IFN)-γ und Tumor Nekrosefaktor(TNF)-α induziert und in Zellen des Immunsystems exprimiert. Auf der Suche nach einem E1 Enzym, welches FAT10 an seinem C-Terminus aktiviert, haben wir das E1 Enzym UBE1L2 (MOP-4) charakterisiert, welches inzwischen mit UBA6 bezeichnet wird. Erstaunlicherweise konnten wir zeigen, dass UBA6 GST-ubiquitin, nicht aber FAT10 aktiviert. Damit ist uns 25 Jahre nach der Entdeckung des prinzipiellen E1 Enzyms UBE1 die Entdeckung eines zweiten ubiquitin-aktivierenden Enzyms gelungen. Bei der weiteren Charakterisierung von UBA6 haben wir und die Gruppe von Z. Chen gefunden, dass FAT10 mit einem kleineren N-terminalen tag als GST in vitro und in Zellen effizient von UBA6 aktiviert wird. UBA6 ist also ein bispezifisches E1 Enzym für Ubiquitin und FAT10. Die siRNA vermittelte Depletion von UBA6 in Zellen führte dazu, dass endogen oder exogen exprimiertes FAT10 nicht mehr an seine Substratproteine konjugiert werden kann. Kürzlich konnten wir den Autophagieadaptor p62/Sequestosom-1 als ein Substrat der FAT10ylierung massenspektrometrisch identifizieren und biochemisch bestätigen. Auch die Konjugation von FAT10 an das Einzelsubstrat p62 war abhängig von der Expression von UBA6. Einen Einfluss der Depletion von UBA6 auf die Menge an Ubiquitinkonjugaten in HEK293 Zellen konnten wir aber nicht feststellen. Auch zeigten diese Zellen bei Mangel an UBA6 keinen Zellzyklusarrest, keine Inhibition der Zellteilung und kein schlechteres Überleben. Durch einen Interaktionsscreen in der Hefe konnten wir das E2 Enzym USE1 als Bindepartner von UBA6 identifizieren. USE1 kann aktiviertes Ubiquitin nur von UBA6, nicht aber von UBE1 übernehmen. USE1 ist ein bispezifisches Enzym, da es sowohl aktiviertes Ubiquitin als auch aktiviertes FAT10 von UBA6 übernehmen kann. Die Depletion von USE1 führt genau wie die Depletion von UBA6 zu einer Blockierung der FAT10ylierung von Substratproteinen, was belegt, dass USE1 ein sehr bedeutsames E2 Enzym in der FAT10ylierungskaskade ist. Interessanterweise auto-modifiziert sich USE1 mit FAT10 in cis, nicht aber mit Ubiquitin. Ein zweites in diesem UBA6 - Interaktionsscreen identifiziertes Enzym ist das sehr grosse E2/E3 Enzym Bruce. Wir konnten zeigen, dass UBA6 mit Bruce co-immunpräzipitiert, und dass FAT10 an Bruce reduzierbar bindet. Leider konnten wir in vitro bisher noch keinen Transfer von aktiviertem FAT10 von UBA6 auf Bruce nachweisen. In einem weiteren Interaktionsscreen in der Hefe mit dem E2 Enzym USE1 konnte die interferon-γ induzierbare Ring E3 ligase Trim11 als ein Bindepartner von USE1 identifiziert werden, die in Anwesenheit von rekombinantem UBA6 und USE1 zwar poly-ubiquityliert, nicht aber FAT10yliert wird. Eine siRNA vermittelte Depletion von Trim11 hingegen führte zu einer starken Verringerung von FAT10 Konjugaten, was für eine Funktion von Trim11 in der FAT10 Konjugierungskaskade spricht. Es könnte also sein, dass wir mit UBA6, USE1 und Trim11 eine ganze Kaskade mit zweifacher Spezifität für Ubiquitin und FAT10 identifiziert haben, welches ein völlig neues Paradigma in der Konjugierung von Modifikatoren der Ubiquitinfamilie wäre.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2008). Activating the ubiquitin family: UBA6 challenges the field. Trends Biol. Chem. 33:230-237
Groettrup, M., Pelzer, C., Schmidtke, G., and Hofmann, K.
- (2010) FAT10: Activated by UBA6 and Functioning in Protein Degradation; in M. Groettrup, Editor, Conjugation and Deconjugation of Ubiquitin Family Modifiers 54: Landes Bioscience, Austin, pp. 238-246
Pelzer, C., and Groettrup, M.
- (2010). USE1 is a bispecific conjugating enzyme for ubiquitin and FAT10 which FAT10ylates itself in cis. Nature Comm. 1
Aichem, A., Pelzer, C., Lukasiak, S., Kalveram, B., Sheppard, P.W., Rani, N., Schmidtke, G., Groettrup, M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms1012)
