Microarray-Analysen mit Azol-adaptierten Fusarium graminearum - Isolaten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bei Vorliegen der entsprechenden Witterung kann Fusarium graminearum die Weizenproduktion in vielen Anbaugebieten gefährden, vor allem auf Grund seiner Fähigkeit Mycotoxine zu bilden. Dieser Pilz läßt sich durch Azole kontrollieren. Die Sequenzierung seines Genomes ermöglicht die Entwicklung und Verwendung molekularer Werkzeuge, um Wirkmechanismen von Fungiziden aufzuklären und eine Abschätzung der Entstehung von Resistenzen vornehmen zu können. In diesem Projekt wurde auf Basis der Agilent Plattform ein neuer Microarray im 8x15k Multiplex Format für F. graminearum entwickelt. Zunächst wurden auf einem Vorläufer-Array des Formats 2x105k für jedes der etwas mehr als 13.000 Gene mehrere Oligonukleotide synthetisiert. Dieser Array wurde mit Cy3-markierten cRNAs und genomischer DNA hybridisiert. Die statistische Auswertung der erhaltenen Signale führte zur Bestimmung von meist einem, bzw. in 14% der Fälle zwei Oligonukleotiden, die für das finale 8x15k Format verwendet wurden. Für ein erstes Microarray Experiment wurde ein Wildtypstamm von F. graminearum mit 5 ppm Tebuconazol für 12 h behandelt, aus diesem RNA extrahiert, die in Cy3-markierte cRNA umgeschrieben wurde. Die statistische Analyse der erhaltenen Hybridisiersignale zeigte beim Vergleich mit einer unbehandelten Kontrollkultur, daß 596 Gene signifikant höhere und 462 signifikant niedrigere Transkriptgehalte aufwiesen. Die Analyse durch die Programme GeneOntology und FunCat zeigte, daß unter den hochregulierten Gene, solche am signifikantesten angereichert waren, die im Ergosterol-Biosyntheseweg stehen, insbesondere auch die drei Gene, die das molekulare Target CYP51 codieren. Darüber hinaus wurden unter den 54 ABC-Transportern sechs gefunden, die signifikant hochreguliert waren und vermutlich dazu beitragen, daß F. graminearum mäßigen Fungizidstreß überlebt. Unter allen Genen, die Transkriptionsfaktoren codieren wurden 21 gefunden, die signifikant erhöhte Transkriptgehalte aufwiesen. Interessanterweise besaßen einige von diesen hohe Ähnlichkeit zu solchen, die in Hefen als Regulatoren der Fungizid-Antwort funktionell bestätigt sind. In einem weiteren Microarray Experiment wurden adaptierte Isolate untersucht, die für 33 d 10 ppm Tebuconazol ausgesetzt waren. Im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen konnten wir zeigen, daß spezifische Transkriptom-Änderungen nach Fungizid-Adaptation auftreten. Der in diesem Projekt entwickelte und validierte Microarray erlaubt zukünftig in F. graminearum sensitiv und reproduzierbar Transkriptomdaten zu gewinnen, die eine effiziente Bestimmung von Kandidatengenen für weiterführende funktionelle Untersuchungen gestatten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010). "Adaptation of Fusarium graminearum to Tebuconazole Yielded Descendants Diverging for Levels of Fitness, Fungicide Resistance, Virulence, and Mycotoxin Production." Phytopathology 100(5): 444-453
Becher, R., Hettwer, U., Karlovsky, P., Deising, H. B., Wirsel, S. G. R.
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(2010). "Genome-wide expression profiling of the response to an azole fungicide in Fusarium graminearum, using a novel multiplex Agilent DNA microarray." BMC Genomics
Rayko Becher, Fabian Weihmann, Holger B. Deising, and Stefan G. R. Wirsel
