Genome Sequencer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das GSFLX Sequenziergerät wurde im Institut für Humangenetik in der Core Unit for Applied Genomics implementiert. Wenngleich die technische Entwicklung in den ersten drei Jahren erhebliche weitere Investitionen in die Next-Generation-Sequencing Service-Einheit erforderlich machte, konnte über die Platzierung des GSFLX Sequencers am Standort dauerhaft eine leistungsfähige Einheit etabliert werden. Neben der Shotgun-Sequenzierung von kleinen bakteriellen Genomen und Metagenom 16S-Sequenzierungen für Tübinger Mikrobiologen (Prof. Dr. Andreas Peschel; Prof. Dr. Julia Fricks) wurden insbesondere Amplicon-Sequenziermethoden und On-Array und In-Solution Enrichment Methoden für humangenetische Fragestellungen entwickelt. In Kooperation mit der onkologischen Arbeitsgruppe der Universitätshautklinik Tübingen (Prof. Dr. Klaus Garbe; Prof. Dr. Jürgen Bauer) wurden cDNA-Bibliotheken aus Melanom-Operationspräparaten sequenziert und hinsichtlich etwaiger viraler Sequenz-Fragmente ausgewertet, um Indizien für eine möglicherweise virale Ätiologie des malignen Melanoms aufzuspüren. Eine 2011 von uns publizierte Arbeit konnte allerdings keine viralen Sequenzfragmente nachweisen. Mit Prof. Dr. Mark Berneburg (Universitätshautklinik Tübingen) haben wir licht-expositionsbedingte Mutationsereignisse in Hautbiopsien von Patienten mit Xeroderma Pigmentosum Typ C (XPC) bestimmt. Dabei zeigte sich, dass lichtexponierte Hautareale bei diesem genetisch bedingten Mismatch-Repair-Defekt massiv somatische Mutationen im Sinne von Transitionen anreichern. Dabei werden ein Mutationsgrad (als Mosaik-Anteil quantifiziert) und eine Menge von somatischen Mutationen entdeckt, wie sie selbst in stark fortgeschrittenen malignen Neoplasmen (zum Beispiel dem Hepatozellulären Karzinom) nicht annähernd so zahlreich sind. Diese Datensätze haben wir zuletzt durch Hoch-Durchsatz Exom-Sequenzierungen (auf einem Illumina GA2x-Sequenzierer) ergänzt. In einer neurogenetischen Kooperationsarbeit (TECHGENE, EU-gefördert) konnten wir die Häufigkeit von SPG7 und SPG5 Mutationsträgern in einem Kollektiv von sporadischen Paraplegie-Patienten durch amplifikat-basiertes Next-Generation-Sequencing bestimmen. Eine miniaturisierte PCR-Methode (fluidigm, Access-Array) erlaubt die parallel Generierung von >2.300 Amplifikaten pro Ansatz und schließlich die komplette Sequenzierung von 187 Patienten für diese genannten Gene. Sieben SPG7 und drei SPG5-Patienten wurden zweifelsfrei identifiziert und gleichzeitig diagnostisch Stärken und Schwächen dieser Methode publiziert. Aufwendig, aber auch wegweisend waren Sequenzierprojekte zu somatischen Mutationen bei Tumorpatienten, welche Variantenlisten für eine mögliche tumorspezifische Impfung liefern sollten. Mit der 454-Sequenziertechnologie haben wir dabei zunächst fokussiert tumor-assoziierte Gene (wie CTNB1, TP53, u.v.m) sequenziert, dabei aber feststellen müssen, dass wir durch die technische / budgetäre Limitation auf wenige Hundert Gene nicht in allen untersuchten Proben tumorspezifische Varianten entdecken konnten. Mit der Verfügbarkeit von Exom-Sequenzierungen (WES) auf der Illumina-Platform wurden diese Projekte relativ günstiger, so dass die Projektmittel (SFB 685; Sprecher Prof. Dr. Hans-Georg Rammensee; BMBF-Projekt IndividuaLiver) konsequent für WES umgewidmet wurden und der 454-Sequencer ab Frühjahr 2010 für diese Projekte nicht mehr eingesetzt wurde. Ebenso haben wir 2010 einige Kandidatengen-Regionen in großen Familien mit neurodegenerativen Erkrankungen angereichert und sequenziert: Eine große dominante Parkinson-Familie wurde für die Kandidatengen-Region auf Chromosom 7p angereichert und sequenziert. Die Sequenzierergebnisse sind noch unpubliziert, weil sich bisher keine pathogene Mutation nachweisen lies. Ebenso wenig konnte die krankheitsverursachende Mutation in einer großen chilenischen Paraplegie-Familie mit Kopplung zu Chromosom 12 oder zu einer großen deutschen Paraplegie-Familie mit Kopplung auf Chromosom 12 abschließend gefunden werden, wenngleich zumindest für die deutsche Familie eine interessante genomische Deletion im Kandidatengen-Intervall detektiert werden konnte.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Clin Genet. 2011 Aug;80(2):148-60
Schlipf et al.
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Exp Dermatol. 2011 Sep;20(9):766-8
Feldhahn et al.
