Struktur und Funktion von Ecto-Nukleotidasen in der purinergen Signaltransduktion

• Antragsteller: Professor Dr. Norbert Sträter
• Subject Area: Strukturbiologie ; Biochemie
• Term: from 2011 to 2020
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 188357192

Neben seiner wichtigen Funktion im Metabolismus der Zelle dient ATP auch als extrazelluläre Signalsubstanz. Extrazelluläre Nukleotide beeinflussen eine große Vielfalt von physiologischen Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Entzündung, mechanosensorische Schmerzwahrnehmung, Blutplättchenaggregation und der endothelvermittelten Vasodilatation. Weiterhin sind die Proliferation, Differenzierung, Migration und der Tod von Zellen zu nennen zum Beispiel in Entwicklungsprozessen, Regeneration sowie der Krebsentstehung. Extrazelluläre Nukleotidasen sind in den Metabolismus dieser Nukleotide involviert. Die NTPDasen (Ecto-Nukleosidtriphosphat-Diphosphohydrolasen) dephosphorylieren ATP über ADP zu AMP. Die NTPDasen 1, 2, 3 und 8 sind extrazellulär membranverankert und fungieren in der purinergen Signaltransduktion während die NTPDasen 4-7 in intrazellulären Organellen wie dem Golgi lokalisiert sind. Dort sind sie in die Proteinglykosylierung involviert und setzen NDPs zu NMPs um, um eine Inhibition der Glykosyltransferasen zu verhindern und um das NMP für den Austausch gegen NDP-Zucker durch Antiporter bereit zu stellen. Neben den NTPDasen sind die Nukleotid- Pyrophosphatasen/Phosphodiesterasen (NPPs) am extrazellulären Nukleotidmetabolismus beteiligt.Ziel des Projektes ist die Charakterisierung der molekularen Strukturen und katalytischen Mechanismen der NTPDasen durch Röntgenkristallographie, Mutagenesestudien und Aktivitätsassays. Ein Hauptaugenmerk liegt dabei auf den in die Proteinglykosylierung involvierten intrazellulären NTPDasen. Der Aufbau der aktiven Zentren und die charakteristische Substratspezifität dieser Enzyme kann nicht auf der Basis von Homologiemodellen verstanden werden. Daher werden wir die Kristallstrukturen der NTPDasen 4-7 bestimmen. Kokristallstrukturen mit Substraten und Inhibitoren werden die molekulare Basis für die Unterschiede in der Substratspezifität (NDP zu NTP und für verschiedene Nukleobasen) aufzeigen. Die NTPDase1 hydrolysiert ATP zu AMP ohne Freisetzung von ADP. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Prozessivität von der Membranverankerung des Enzyms abhängt. Über Mutagenesestudien werden wir die Hypothese überprüfen, dass die in der Kristallstruktur beobachtete lange, hydrophobe, konservierte Schlaufe in den extrazellulären NTPDasen an der Membranverankerung und Prozessivität beteiligt ist. Wir werden Strukturen der ecto-NTPDasen 3 und 8 bestimmen. Ein anderer Projektteil befasst sich mit der Spezifität und dem Mechanismus der NPPs. Es gelang uns, erstmals die NPP3 zu kristallisieren. Wir werden die Struktur des Enzyms bestimmen und Kokristallstrukturen mit verschiedenen Substraten und -produkten analysieren, um die Unterschiede in der Substratspezifität zwischen den an der purinergen Signaltransduktion und Kalzifizierung beteiligten NPPs zu verstehen. In Zusammenarbeit wirken wir an der Entwicklung spezifischer Inhibitoren für diese Enzyme als biologische und pharmazeutische Werkzeuge mit.

• DFG Programme: Sachbeihilfen