Molekulare Evolution von Elongationsfaktor P in Escherichia coli
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Dieses Forschungsprojekt zielte darauf ab, die natürlichen Variationen des Elongationsfaktors P (EF-P) molekular besser zu verstehen und eine evolvierte Variante für die heterologe Expression von Polyprolin-haltigen Proteinen in Escherichia coli zu generieren. Während der Translation von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Prolinen kommt es zu einer Ribosomenpause, die durch EF-P aufgehoben werden kann. EF-P ist normalerweise nur nach posttranslationaler Modifikation aktiv. Beispielsweise, wird EF-P in dem vielfältig als Chassis für biotechnologische Anwendungen genutzten E. coli ß-lysinyliert, wofür die Aktivität von zwei Enzymen, der L-Lysin-2,3-Aminomutase EpmB und der (R)-ß-Lysin-Ligase EpmA, notwendig ist. Während in E. coli nur eine moderate Anzahl von Polyprolin-Motiven vorkommt, übersteigt die Anzahl dieser Motive die Gesamtzahl der kodierten Proteine in Actinobacteria. Insbesondere sind diese Polyprolin-Motive in Proteinen des Sekundärstoffwechsels, z.B. für die Synthese von Polyketiden in Streptomyces-Spezies, akkumuliert. Dieses Projekt basierte auf unseren früheren Ergebnissen, wonach Streptomyceten und andere Actinobacteria ein EF-P verwenden, das ohne jegliche post-translationale Modifikation funktionsfähig ist, und damit diese Belastung kompensieren. Charakteristisch für diese Art von EF-P ist eine starre Schleife (Pro- Gly-Lys-Gly-Pro), in die die normalerweise modifizierte Aminosäure eingebettet ist. Diese Schleife ist namensgebend für die EF-P PGKGP-Unterfamilie. Im Rahmen des Projektes ist es uns gelungen: 1. ein natürlich vorkommendes unmodifiziertes EF-P zu finden, das in E. coli voll funktionsfähig ist, 2. durch gezielte Mutagenese herauszufinden, warum dieses EF-P der PGKGP-Unterfamilie aktiv ist und 3. ein natürlich vorkommendes unmodifiziertes EF-P, das in E. coli inaktiv ist, durch Anwendung der in (2.) erarbeiteten Designregeln in eine aktive Variante umzuwandeln. In einem zweiten Teil haben wir ein in vivo Reportersystem entwickelt, das die Stärke von Ribosomenpausen in der Translation im Hochdurchsatzverfahren visualisiert und für jeden bakteriellen Translationsfaktor geeignet ist. Mit diesen Ergebnissen haben wir nicht nur den Werkzeugkasten für die Synthetische Biologie erweitert, sondern neue funktionelle und mechanistische Einsichten in den fundamentalen Prozess der Translation erhalten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Decrypting the functional design of unmodified translation elongation factor P. Cell Reports, 43(5), 114063.
Tomasiunaite, Urte; Kielkowski, Pavel; Krafczyk, Ralph; Forné, Ignasi; Imhof, Axel & Jung, Kirsten
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Versatile Dual Reporter to Identify Ribosome Pausing Motifs Alleviated by Translation Elongation Factor P. ACS Synthetic Biology, 13(11), 3698-3710.
Tomasiunaite, Urte; Brewer, Tess; Burdack, Korinna; Brameyer, Sophie & Jung, Kirsten
